ዜና

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ አለው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
የካንሰር ሕዋሳት ሴሉላር ጭንቀትን ለማሸነፍ እና እድገታቸውን ለመቀጠል የተለያዩ ዘዴዎችን ፈጥረዋል።ፕሮቲን ኪናሴ አር (PKR) እና የፕሮቲን አክቲቪስቱ (PACT) የሴል ስርጭትን እና አፖፕቶሲስን ወደ መከልከል የሚያመሩ የተለያዩ የጭንቀት ምልክቶችን የሚቆጣጠሩ የመጀመሪያ ምላሽ ሰጪዎች ናቸው።ነገር ግን፣ በካንሰር ሕዋሳት ውስጥ ያለው የPACT-PKR መንገድ ደንብ ብዙም የማይታወቅ ነው።እዚህ ፣ ረጅም ኮድ ያልሆነ አር ኤን ኤ (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase አንቲሴንስ አር ኤን ኤ 1 (DARS-AS1) የ PACT-PKR መንገዱን በመከልከል እና የካንሰር ሕዋሳት መስፋፋትን የሚያበረታታ መሆኑን አግኝተናል።የ CRISPRi 971 ከካንሰር ጋር የተገናኘ lncRNA መጠነ ሰፊ ተግባራዊ ምርመራን በመጠቀም፣ DARS-AS1 ከተሻሻለ የካንሰር ሕዋስ ስርጭት ጋር የተቆራኘ መሆኑን ደርሰንበታል።ስለዚህ, DARS-AS1 knockout የሕዋስ መስፋፋትን ይከላከላል እና የካንሰር ሕዋስ አፖፕቶሲስን በተለያዩ የካንሰር ሴል መስመሮች ውስጥ በብልቃጥ ውስጥ ያበረታታል እና በ Vivo ውስጥ የእጢ እድገትን በእጅጉ ይቀንሳል.በሜካኒካል፣ DARS-AS1 ከPACT ማግበር ጎራ ጋር በቀጥታ ይተሳሰራል እና የPACT-PKR መስተጋብርን ይከላከላል፣በዚህም የPKR ገቢርን፣ eIF2α ፎስፈረስላይዜሽን ይቀንሳል እና የአፖፖቲክ ሴል ሞትን ይከለክላል።ክሊኒካዊ በሆነ መልኩ, DARS-AS1 በበርካታ ካንሰሮች ውስጥ በሰፊው ይገለጻል, እና የዚህ lncRNA ከመጠን በላይ መጨመር ደካማ ትንበያዎችን ያሳያል.ይህ ጥናት በDARS-AS1 lncRNA የPACT-PKR መንገድን ካንሰር-ተኮር ደንብ ያብራራል እና ለካንሰር ትንበያ እና ህክምና ሌላ ዒላማ ይሰጣል።
ከውጥረት ጋር የመላመድ ችሎታ የካንሰር ሕዋሳት መትረፍ እና መስፋፋት አስፈላጊ ባህሪ ነው.የካንሰር ፈጣን መስፋፋት እና የሜታቦሊዝም ምልክቶች በአስቸጋሪ ማይክሮኢነሮች ውስጥ ከፍተኛ ደረጃ ላይ ይገኛሉ - የተመጣጠነ ምግብ እጥረት ፣ hypoxia እና ዝቅተኛ ፒኤች - ይህም የሕዋስ ሞት ምልክት መንገዶችን ያስከትላል።እንደ p535, የሙቀት ድንጋጤ ፕሮቲኖች 6, 7, KRAS8, 9, እና HIF-110, 11, 12, 13 የመሳሰሉ ውጥረትን የሚነኩ ጂኖችን መቆጣጠር በካንሰር ውስጥ በተደጋጋሚ ይስተዋላል, በዚህም አፖፕቶሲስን በመዝጋት እና መትረፍን ያበረታታል.
ፕሮቲን ኪናሴ አር (PKR) የሴሉላር ጭንቀትን ከሴል ሞት ጋር የሚያገናኝ የትርጉም ተቆጣጣሪ እና የ eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) ጠቃሚ የጭንቀት ዳሳሽ እና ንዑስ ኪናሴ ነው።PKR መጀመሪያ ላይ እንደ ፀረ-ቫይረስ ፕሮቲን የታወቀው ባዕድ ባለ ሁለት ገመድ አር ኤን ኤ (dsRNA) በማግኘቱ ነው።ሲነቃ PKR phosphorylates eIF2a የቫይራል እና ሴሉላር ፕሮቲን ውህደትን ለመግታት 14,15,16.PACT (PKR activator ፕሮቲን) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 በሌለበት ጊዜ የመጀመሪያው PKR አግብር ፕሮቲን ተለይቷል.ከPKR ጋር በቀጥታ በመገናኘት፣ PACT የተለያዩ ጭንቀቶችን (የሴረም ረሃብን፣ የፔሮክሳይድ ወይም የአርሴኔት ሕክምናን) ወደ PKR እና የታችኛው ተፋሰስ ምልክት መንገዶችን ያስተላልፋል።ከ eIF2a phosphorylation በተጨማሪ፣ በPACT-መካከለኛ PKR ማግበር ከውጥረት ምላሽ ጋር የተያያዙ የተለያዩ ክስተቶችን ያስነሳል፣ በ PI3K/Akt24 መንገድ በኩል የተቀየረ የመልሶ ማቋቋም ሁኔታ፣ በp5325,26 እና NF-κB27,28 የተሻሻለ የዲ ኤን ኤ ጉዳት መፈተሻን ጨምሮ ከውጥረት ምላሽ ጋር የተያያዙ የተለያዩ ክስተቶችን፣ 29. በውጥረት ምላሽ፣ መስፋፋት፣ አፖፕቶሲስ እና ሌሎች ቁልፍ ሴሉላር ሂደቶች ላይ ያላቸውን ወሳኝ ሚና ግምት ውስጥ በማስገባት፣ PKR እና PACT ለብዙ በሽታዎች በተለይም ካንሰር30,31,32,33 ተስፋ ሰጪ የሕክምና ዒላማዎች ናቸው።ሆኖም፣ ይህ የፕሌዮትሮፒክ ተግባራዊ እና ባዮሎጂካል ጠቀሜታ ቢኖረውም፣ በካንሰር ሕዋሳት ውስጥ ያለው የPACT/PKR እንቅስቃሴ ቁጥጥር አሁንም ቀላል አይደለም።
lncRNAs ከ200 ኑክሊዮታይድ የሚበልጡ የፕሮቲን ኮድ የመስጠት አቅም የሌላቸው ቅጂዎች ናቸው።ሙሉ ለሙሉ የጂኖም ተከታታይ ፕሮጄክቶች በሺዎች የሚቆጠሩ lncRNAs ለይተው ካወቁ በኋላ 35,36 ባዮሎጂያዊ ተግባራቸውን ለማብራራት ብዙ ጥረት ተደርጓል።እያደገ የመጣ የምርምር አካል lncRNAs በብዙ ባዮሎጂካል ሂደቶች37 ውስጥ የ X-ክሮሞዞም ኢንአክቲቬሽን 38,39, ማተም40, ግልባጭ 41,42, ትርጉም43 እና የካንሰር እድገትን ጨምሮ44,45,46,47 ጨምሮ.እነዚህ ጥናቶች ብዙ lncRNAs በPACT/PKR መንገድ ላይ እንደሚሳተፉ ዘግበዋል።አንድ እንደዚህ ዓይነት ጥናት እንደሚያሳየው lncRNA ASPACT የPACT ቅጂ እንዳይገለበጥ እና የPACT mRNA የኒውክሌር ማቆየት እንዲጨምር አድርጓል።ሌሎች ጥናቶች እንደሚያሳዩት lncRNA nc886 ከ PKR ጋር የተቆራኘ እና phosphorylation 49,50 ይከላከላል.እስካሁን፣ lncRNA የሚቆጣጠረው PACT-መካከለኛ PKR ማግበር ሪፖርት አልተደረገም።
Aspartyl-tRNA synthetase አንቲሴንስ አር ኤን ኤ 1 (DARS-AS1) እንደ ኦንኮጂን lncRNA51,52,53,54 ተለይቷል.በ miP-194-5p53፣ miP-12952 እና miP-532-3p51፣ DARS-AS1 እንደቅደም ተከተላቸው የጠራ ሕዋስ የኩላሊት ሴል ካርሲኖማ፣ ታይሮይድ ካርሲኖማ እና አነስተኛ ሴል የሳንባ ካንሰር እድገትን እንደሚያሳድግ ታይቷል።ቶንግ እና ባልደረቦቻቸው ዳአርኤስ-ኤኤስ1 የፕሮቲን 39 (RBM39) አር ኤን ኤ ማሰሪያ ሞቲፍ መረጋጋትን በመጠበቅ የ myeloma እድገትን እንደሚያበረታታ ደርሰውበታል።ይሁን እንጂ ይህ lncRNA በPACT-PKR አግብር ቁጥጥር እና በካንሰር ሕዋሳት የጭንቀት ምላሽ ውስጥ መሳተፉን በተመለከተ ምንም ጥናቶች አልተካሄዱም።
እዚህ፣ የ CRISPRi ስርዓትን በመጠቀም መጠነ ሰፊ የኪሳራ ስክሪን አከናውነን እና DARS-AS1 lncRNA የበርካታ የካንሰር ሕዋሳት መስፋፋትን እንደሚያበረታታ ወስነናል።በተጨማሪም፣ ዋና ዘዴን ለይተናል፡- DARS-AS1 ከPACT ጋር በቀጥታ ይገናኛል፣PACT እና PKR ትስስርን ይከለክላል፣የ eIF2α ፎስፈረስላይዜሽን ይከላከላል፣ የታችኛው የPKR ንኡስ ክፍል እና በመጨረሻም የአፖፖቲክ ሴል ሞትን ይከለክላል።በማጠቃለያው፣ ስራችን የPACT-PKR መንገዱን ተቆጣጣሪ እና ለካንሰር ህክምና እና ትንበያ ዒላማ አድርጎ እንደ DARS-AS1 lncRNA ያሳያል።
ሰፊ የጂኖም ፕሮፋይል ጥናቶች በመቶዎች የሚቆጠሩ lncRNA ከካንሰር ጋር ተያይዘው ለይተዋል።ሆኖም ተግባራቸው ብዙም የማይታወቅ ነው56.በካንሰር እድገት ውስጥ የተሳተፉትን ተስፋ ሰጪ lncRNA እጩዎችን ለመለየት በ SW620 የኮሎሬክታል ካንሰር ሴል መስመር ላይ የ CRISPRi ስርዓትን በመጠቀም (ምስል 1 ሀ) ውስጥ መስፋፋትን ለመቀነስ የተግባር ማጣት ማሳያን አከናውነናል።የ SW480 እና SW620 የኮሎን ካንሰር ሴል መስመሮች ልዩ ባህሪ በአንድ ታካሚ ውስጥ ከአንደኛ ደረጃ እና ሁለተኛ ደረጃ ዕጢዎች የተገኙ መሆናቸው ነው.ይህ የላቀ የአንጀት ካንሰር እድገትን የጄኔቲክ ለውጦችን ለማጥናት ጠቃሚ ንፅፅርን ይሰጣል።ስለዚህ፣ የአር ኤን ኤ ቅደም ተከተልን በመጠቀም የኮሎሬክታል ካንሰር ሴል መስመሮችን (SW480 እና SW620) ግልባጮችን ተንትነን ከታተሙ ጽሑፎች አንዳንድ ሊሆኑ የሚችሉ ተግባራዊ lncRNAዎችን ሰብስበናል።በእነዚህ ውጤቶች ላይ በመመስረት፣ 7355 sgRNA oligos 971 ከካንሰር ጋር የተገናኙ lncRNAs እና 500 ያልታለመ sgRNA oligosን ለአሉታዊ ቁጥጥር (ተጨማሪ መረጃ 1) የያዘ sgRNA ቤተ-መጽሐፍት ነድፈናል።
የ CRISPRi ስርዓትን በመጠቀም የማጣራት ንድፍ ውክልና።ከማጣሪያ በኋላ b sgRNA ማበልጸግ.አግድም ነጠብጣብ መስመር log2 (የማጠፍ ለውጥ) = ± 0.58 ይወክላል.ቀጥ ያለ ነጥብ ያለው መስመር p ዋጋ = 0.05 ያመለክታል.ጥቁር ነጥቦች ኢላማ ያልሆኑ sgRNAን ይወክላሉ (እንደ ኤንሲ የተሰየመ)።ቀይ ነጠብጣቦች DARS-AS1ን ያነጣጠሩ sgRNAs ናቸው።ሰማያዊ ነጠብጣቦች ቀደም ሲል የተገለጸው oncogenic lncRNA LINC00205ን የሚያነጣጥሩ sgRNAs ናቸው።መታጠፍ ለውጥ = (የተለመደ ንባብ፣ ቀን 17)/(የተለመደ ንባብ፣ ቀን 0)።c DARS-AS1 sgRNA knockdown የሕዋስ እድገትን አግዷል።የስህተት አሞሌዎች የሶስቱ ሙከራዎች ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና።d DARS-AS1 እብጠቶች (TCGA dataset) አገላለጽ።em የDARS-AS1 አገላለጽ BLCA፣ KIRC፣ PRAD፣ LUSC፣ UCEC፣ LUAD፣ LIHC፣ KIRP እና COAD፣ በቅደም ተከተል (TCGA ዳታሴስት) ካሉ ታካሚዎች በተጣመሩ መደበኛ እና ዕጢዎች ናሙናዎች።p-values ​​የተገኙት የተጣመሩ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራን በመጠቀም ነው።
ፕላዝማዱን ከገነባን እና ሌንቲ ቫይረስን ካሸገንን በኋላ፣ dCas9-SW620 የኮሎሬክታል ካንሰር ሴል መስመርን ከላይ በተጠቀሰው ቤተ-መጽሐፍት በአራት ገለልተኛ የኢንፌክሽን ሙከራዎች ቀየርን።የእነዚህ ኢንፌክሽኖች ብዛት (MOI) 0.1-0.3 ነበር, ይህም እያንዳንዱ ሕዋስ በአንድ sgRNA ብቻ ሊተላለፍ እንደሚችል ያመለክታል.በብልቃጥ ባህል ውስጥ ከ18 ቀናት በኋላ የዒላማ sgRNAs የማበልፀግ መገለጫ ከተጣራ በኋላ ቀንሷል ወይም ጨምሯል ፣ያልሆኑ የቁጥጥር ኦሊጎኑክሊዮታይዶች ቁጥር ከቅድመ-ማጣሪያ መገለጫው ጋር ሲነፃፀር በአንፃራዊነት አልተለወጠም ፣ይህ የሚያሳየው ኢላማችን በጣም ስክሪን-ተኮር እንዳለው ያሳያል። ላይብረሪ.ሩዝ.1 ለ እና ተጨማሪ ሰንጠረዥ 1). LINC00205, ቀደም ሲል የሳንባ ካንሰርን እና የጉበት ካንሰርን እድገትን እንደሚያበረታታ ሪፖርት የተደረገው 58,59,60, ተጣራ (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), የዚህን ማጣሪያ አስተማማኝነት ያረጋግጣል (ምስል 1 ለ). LINC00205, ቀደም ሲል የሳንባ ካንሰርን እና የጉበት ካንሰርን እድገትን እንደሚያበረታታ ሪፖርት የተደረገው 58,59,60, ተጣራ (log2 (foldchange) <-0.58, p value <0.05), የዚህን ማጣሪያ አስተማማኝነት ያረጋግጣል (ምስል 1 ለ). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1 ለ)። LINC00205, ቀደም ሲል የሳንባ ካንሰርን እና የጉበት ካንሰርን 58,59,60 እድገትን እንደሚያበረታታ ሪፖርት ተደርጓል, አልተካተተም (log2 (fold change) <-0.58, p-value <0.05), የዚህን ማጣሪያ ጥንካሬ ያረጋግጣል (ምስል 1b) . Linckocko00205 之前 之前 被 报道 报道 可 可 可 可 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 掉 掉 掉 肺癌 掉 掉 掉 掉 掉 掉 (倍数58, P 值 <0.58, P 值 <了] 可靠性 可靠性 可靠性 (图 1 ለ). Linckocko00205 之前 之前 被 报道 报道 可 可 可 可 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 肺癌 掉 掉 掉 肺癌 掉 掉 掉 掉 掉 掉 (倍数58, P 值 <0.58, P 值 <了] 可靠性 可靠性 可靠性 (图 1 ለ). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1 ለ)። LINC00205, ቀደም ሲል የሳንባ እና የጉበት ካንሰር እድገትን እንደሚያበረታታ ሪፖርት የተደረገው 58,59,60, አልተካተተም (ሎግ2 (የማጠፍ ለውጥ) <-0.58, p-value <0.05), የዚህን ማጣሪያ ጥንካሬ ያረጋግጣል (ምስል .1b).
ከተፈተኑት ሁሉም lncRNAs መካከል፣ DARS-AS1 እንዲሁ ተጣርቷል፣ ሶስቱ ኮግኒት sgRNA oligonucleotides ከ18 ቀን ባህል በኋላ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል፣ ይህም የ lncRNA መውደቅ የካንሰርን ስርጭት ቀንሷል (ምስል 1 ለ) ይጠቁማል።ይህ ውጤት በMTS ትንተና በኮሎሬክታል ካንሰር ህዋሶች የተደገፈ ሲሆን የ DARS-AS1 ተንኳሽ ሴሎች እድገት ከቁጥጥር ሴሎች ጋር ሲነፃፀር በግማሽ ቀንሷል (ምስል 1 ሐ) እና ከሌሎች በርካታ የካንሰር ዓይነቶች ቀደም ካሉት ሪፖርቶች ጋር የሚጣጣም መሆኑን ያሳያል ።ግልጽ የሕዋስ የኩላሊት ካንሰር፣ የታይሮይድ ካንሰር እና ትንሽ ያልሆነ ሕዋስ የሳንባ ካንሰር51,52,53,55.ይሁን እንጂ በኮሎሬክታል ካንሰር ውስጥ ያለው ተግባር እና ሞለኪውላዊ ዘዴዎች ገና አልተመረመሩም.ስለዚህ፣ ለተጨማሪ ጥናት ይህንን lncRNA መረጥን።
በሕመምተኞች ላይ የDARS-AS1 አገላለጽ ለማጥናት፣ ከካንሰር ጂኖም አትላስ (TCGA) ፕሮጀክት 10,327 ዕጢ ናሙናዎችን በጥልቀት ተንትነናል።ውጤታችን እንደሚያሳየው DARS-AS1 በጤናማ ህዋሶች ውስጥ በሰፊው የሚገለፅ እና በከፍተኛ ሁኔታ የሚስተካከል በተለያዩ እብጠቶች ማለትም ኮሎን አድኖካርሲኖማ (COAD)፣ የኩላሊት ግልፅ ሴል ካርሲኖማ (KIRC) እና የኩላሊት ፓፒላሪ ሴል ካርሲኖማ (KIRP) ናቸው።.በጣም ጥቂት (ምስል 1 ዲ እና ተጨማሪ ምስል 1 ሀ, ለ). የተጣመሩ ጤናማ/ዕጢ ናሙናዎች ትንተና በፊኛ urothelial ካርስኖማ (BLCA)፣ የኩላሊት የኩላሊት ጥርት ሴል ካርስኖማ (KIRC)፣ የፕሮስቴት አድኖካርሲኖማ (PRAD)፣ የሳንባ ስኩዌመስ ሴል ካርሲኖማ (LUSC) ዕጢዎች ውስጥ የ DARS-AS1 ከፍተኛ መግለጫ አረጋግጧል። , የማኅጸን ኮርፐስ ኢንዶሜትሪየም ካርሲኖማ (UCEC), የሳንባ adenocarcinoma (LUAD), የጉበት ሄፓቶሴሉላር ካርሲኖማ (LIHC), የኩላሊት የኩላሊት ፓፒላሪ ሴል ካርሲኖማ (KIRP), ኮሎን አዶኖካርሲኖማ (COAD) (p ዋጋ <0.05) (ምስል 1e-m) . የተጣመሩ ጤናማ/ዕጢ ናሙናዎች ትንተና በፊኛ urothelial ካርስኖማ (BLCA)፣ የኩላሊት የኩላሊት ጥርት ሴል ካርስኖማ (KIRC)፣ የፕሮስቴት አድኖካርሲኖማ (PRAD)፣ የሳንባ ስኩዌመስ ሴል ካርሲኖማ (LUSC) ዕጢዎች ውስጥ የ DARS-AS1 ከፍተኛ መግለጫ አረጋግጧል። , የማኅጸን ኮርፐስ ኢንዶሜትሪየም ካርሲኖማ (UCEC), የሳንባ adenocarcinoma (LUAD), የጉበት ሄፓቶሴሉላር ካርሲኖማ (LIHC), የኩላሊት የኩላሊት ፓፒላሪ ሴል ካርሲኖማ (KIRP), ኮሎን አዶኖካርሲኖማ (COAD) (p ዋጋ <0.05) (ምስል 1e-m) .የተጣመሩ ጤናማ/ዕጢ ናሙናዎች ትንተና በተጨማሪም የ DARS-AS1 በፊኛ urothelial ካርስኖማ (BLCA)፣ ግልጽ ሴል የኩላሊት እና የኩላሊት ሴል ካርስኖማ (KIRC)፣ የፕሮስቴት አድኖካርሲኖማ (PRAD)፣ የሳንባ ስኩዌመስ ሴል ካርሲኖማ (LUSC) እጢዎች ላይ የDARS-AS1 ከፍተኛ መግለጫ አረጋግጧል።, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– መ) , ኮርፐስ uteri endometrial ካርስኖማ (UCEC), adenocarcinoma የሳንባ (LUAD), የጉበት hepatocellular ካርስኖማ (LIHC), የኩላሊት papillary ሴል ካርስኖማ (KIRP), እና adenocarcinoma ኮሎን (COAD) (p ዋጋ << 0.05) (ምስል 1e- m) .配对 健康 / 肿瘤样本 肿瘤样本 肿瘤样本 分析 证实 证实 证实 证实 了 了 证实 了 证实 在 在 尿路 尿路 皮癌 上 (ብሉ), 肾 肾 透明 细胞癌 (ክራን), 前列 前列 (Prat), 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 表达 表达, 子宫体子宫 表达 表达 (UCEC), 肺腺癌 (LECEC), 肝肝 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾 乳头状 乳头状 (KIRP) 和结肠腺癌 (CAAD) (P 值) <0.05) (1e-m)配 对 健康 肿瘤样本 肿瘤样本 肿瘤样本 肿瘤样本 肿瘤样本 证实 了 证实 证实 证实 了上 在 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 细胞癌 前列 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (Prnd), 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 (ኪርፕ) (ኮድ) （p 值<0.05） (图1e-m)።የጤነኛ/ዕጢ ጥምር ናሙናዎች ትንተና የ DARS-AS1ን ሚና በፊኛ urothelial carcinoma (BLCA)፣ ጥርት ያለ ሴል የኩላሊት ሴል ካርስኖማ (KIRC)፣ የፕሮስቴት አድኖካርሲኖማ (PRAD) እና የሳንባ ስኩዌመስ ሴል ካርሲኖማ (LUSC) እጢዎች ላይ ያለውን ሚና ደግፏል።экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -ኤም) በኮርፐስ ማሕፀን ካርሲኖማ (UCEC), የሳንባ adenocarcinoma (LUAD), ሄፓቶሴሉላር ካርሲኖማ (LIHC), የኩላሊት ፓፒላሪ ሴል ካርሲኖማ (KIRP) እና ኮሎን አዶኖካርሲኖማ (COAD) (p ዋጋ <0.05) (ምስል 1e -m) መግለጫ.እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሲደመር DARS-AS1 በተለያዩ የካንሰር አይነቶች ውስጥ በስፋት እና በከፍተኛ ደረጃ እንደሚገለጽ ያመለክታሉ።
DARS-AS1 እና DARS (የ አንቲሴንስ ስትራንድ ጂን ኢንኮዲንግ) ተመሳሳይ አስተዋዋቂ ስለሚጋሩ እና እርስ በርሳቸው አጠገብ ስለሚገኙ፣ shRNA ን ነድፈነዋል DARS-AS1ን በተለይ ዳአርኤስን ለማጥፋት ሳይሆን (ተጨማሪ ምስል 2a፣b እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 2) .ከ SW620 በተጨማሪ፣ የ shRNA knockdownን ውጤታማነት እና ተግባር ለማጥናት DARS-AS1ን በከፍተኛ ደረጃ የሚገልጹ ሶስት ሌሎች የሕዋስ መስመሮችን ተጠቀምን (ተጨማሪ ሠንጠረዥ 3)።ውጤታችን እንደሚያሳየው የተገነቡት ሶስቱም shRNAs ቢያንስ 80% የDARS-AS1 ተንኳሽ ብቃት በDARS mRNA (ተጨማሪ ምስል 2c–f) መጠን ላይ ምንም ተጽእኖ ሳይኖራቸው ማሳካት ችለዋል።በተጨማሪም፣ DARS-AS1 ከእነዚህ shRNAs ጋር መውረድ የኮሎሬክታል ካንሰር ሴል መስመሮች SW620 (49.7%) እና HCT116 (27.7%)፣ የጡት ካንሰር ሴል መስመር MBA-MD-231 (53.4%) የሕዋስ እድገትን በእጅጉ እንደሚገታ ደርሰንበታል።) እና የሄፕጂ 2 ሄፓቶማ ሴል መስመር (92.7% ቅነሳ), እንዲሁም ያልተጣበቁ ሉልዎችን የመፍጠር ችሎታቸው (በአማካኝ ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% እና 75.7% per cell line) (ምስል 2a,b).በ SW620 ውስጥ፣ የቅኝ ግዛት ምስረታ ጥናት ውጤት DARS-AS1 shRNA በአማካይ በግምት 69.6% ቀንሷል (ምስል 2 ሐ) የሕዋስ መስፋፋትን በከፍተኛ ሁኔታ እንደከለከለ አረጋግጧል።
በ SW620, HCT116, MBA-MD-231 እና HepG2 ሴሎች ውስጥ የቁጥጥር shRNA እና DARS-AS1 shRNA በሴሎች መስፋፋት (a) እና spheroid ምስረታ (b) ላይ ተጽእኖ.c የቁጥጥር shRNA እና DARS-AS1 shRNA በ SW620 ሴሎች ውስጥ በቅኝ ግዛት መፈጠር ላይ ያለው ተጽእኖ።የሕዋስ መስፋፋት (መ)፣ የስፔሮይድ ምስረታ (ሠ) እና የቅኝ ግዛት ምስረታ (ረ) የ SW620 ሕዋሳት DARS-AS1ን ከመጠን በላይ የሚጨምሩ።የሚታየው መረጃ የሶስት ሙከራዎች አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ነው።* p ≤ 0.05፣ ** p ≤ 0.01፣ እና *** p ≤ 0.001 በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና።
የተግባር ማጣት ጥናቶችን ለማሟላት፣ በቀጣይ DARS-AS1 (ተጨማሪ ምስል 2ግ) የሚጨምሩ SW620 ሴሎችን ፈጠርን።DARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨናነቅ የሕዋስ እድገትን (1.8-fold), ያልተቆራኘ የ spheroid ምስረታ (1.4-fold) እና ቅኝ መፈጠር (3.3-fold) በ SW620 ሕዋሳት (ምስል 2d-f) ጨምሯል.ይህንን ውጤት በሌላ DARS-AS1 ገላጭ የሕዋስ መስመር አ549 አረጋግጠናል።ይህ በ DARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨናነቅ ምክንያት የተሻሻለው የሕዋስ መስፋፋት በ A549 ሕዋሳት (ተጨማሪ ምስል 2h, i እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 3) ታይቷል.እነዚህ የጥቅምና ኪሳራ ጥናቶች አንድ ላይ ሲደመር DARS-AS1 የካንሰር ሕዋሳትን በብልቃጥ ውስጥ መስፋፋትን እንደሚያበረታታ ያሳያሉ።
DARS-AS1 የሕዋስ መስፋፋትን የሚቆጣጠርበትን መሠረታዊ ዘዴ ለመዳሰስ፣ እምቅ የፕሮቲን ትስስር አጋሮቹን ለመለየት የአር ኤን ኤ ተጎታች ትንተና አደረግን።የ RT-qPCR ውጤቶች እንደሚያሳዩት 86.2% የሚሆነው DARS-AS1 በSW620 ሕዋሳት ሳይቶፕላዝም ውስጥ ይገኛል (ተጨማሪ ምስል 3 ሀ)።በብልቃጥ የተገለበጠው ባዮቲንላይድድ DARS-AS1 ወይም pseudoRNA ከዚያም በ SW620 ሕዋስ lysates ተከትሏል ከዚያም በኤስዲኤስ-ገጽ መለያየት።ተከታይ የብር ቀለም እንደሚያሳየው የተለየ ባንድ (~38 ኪ.ዲ.ኤ) በDARS-AS1 ፑት ናሙናዎች በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀገ ቢሆንም በዱሚ አር ኤን ኤ ወይም ዶቃዎች ናሙናዎች (ምስል 3 ሀ) አይደለም።ይህ ባንድ በ mass spectrometry (ኤምኤስ) እንደ PKR የሚያነቃ ፕሮቲን (PACT) ተለይቷል እና በ SW620፣ HCT116 እና HepG2 ሕዋስ መስመሮች (ምስል 3a,b) በ immunoblotting የበለጠ ተረጋግጧል።የDARS እና ተዛማጅ የPACT ፕሮቲኖች - PKR እና TRBP - እንዲሁ በአር ኤን ኤ ትንተና በምዕራባዊ መጥፋት (WB) ተመርምሯል።ውጤቶቹ እንደሚያመለክቱት በDARS-AS1 አር ኤን ኤ እና በእነዚህ ሶስት ፕሮቲኖች መካከል ምንም አይነት ቀጥተኛ መስተጋብር አልተገኘም (ተጨማሪ ምስል 3 ለ)።በ DARS-AS1 እና PACT መካከል ያለው ልዩ መስተጋብር በአር ኤን ኤ የበሽታ መከላከያ (RIP) ትንተና የተረጋገጠ ሲሆን ይህም DARS-AS1 በፀረ-PACT ፀረ እንግዳ አካላት ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀገ ቢሆንም ሌሎች የቁጥጥር አር ኤን ኤዎች አይደሉም (ምስል 3 ሐ)።DARS-AS1 ማንኛውም ሌላ ሴሉላር ክፍሎች በሌሉበት ከPACT ጋር በቀጥታ እንደሚገናኝ ለማወቅ፣ የተጣራ PACTን በመጠቀም የ in vitro biolayer interferometry (BLI) ምርመራ ተካሂዷል።ባዮቲን-የተሰየመው DARS-AS1 ወይም dummy አር ኤን ኤ በስትሬፕታቪዲን (SA) ባዮሴንሰሮች ላይ እንዳይንቀሳቀስ ተደረገ እና ከዚያም 1 μM PACT በያዘ ኪነቲክ ቋት ውስጥ ገብቷል።በተለይ፣ PACT ከ DARS-AS1 (KD value ~26.9 nM) ጋር በጥብቅ የተቆራኘ ነው፣ ነገር ግን አር ኤን ኤ ለመምሰል አይደለም (ምስል 3d)።እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው፣ በ DARS-AS1 እና PACT መካከል ቀጥተኛ መስተጋብር እና ከፍተኛ ግንኙነት ያሳያሉ።
የአር ኤን ኤ ፑል ትንተና DARS-AS1 ከPACT ጋር በSW620 ሕዋሶች ውስጥ መስተጋብር እንደሚፈጥር ለይቷል።ከላይ, ተዛማጅ ፕሮቲኖች የብር ቀለም.ዝቅተኛ የበሽታ መከላከያ ዘዴዎች በፀረ-PACT ፀረ እንግዳ አካላት ተካሂደዋል.b አር ኤን ኤ ፑል-ታች ትንተና በHCT116 (ከላይ) እና በሄፕጂ2 (ታች) ሴሎች ውስጥ ተካሂዷል።የ PACT ማበልጸግ በክትባት በሽታ መከላከያ ተገኝቷል።የcRNA immunoprecipitation (RIP) ምርመራዎች የተጠቆሙ ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በ SW620 ሴሎች ውስጥ ተካሂደዋል።d PACT ማያያዣ ኩርባዎች ወደ ሙሉ-ርዝመት DARS-AS1 ወይም ቁጥጥር አር ኤን ኤ የተገኘው ባዮላይየር ኢንተርፌሮሜትሪ (BLI) በመጠቀም ነው።አር ኤን ኤ በስትሬፕታቪዲን ባዮሴንሰር ላይ እንዳይንቀሳቀስ ተደርጓል።ማህበርን ለመለካት 1 μM PACT ጥቅም ላይ ውሏል።ሠ አር ኤን ኤ ፑል ምርመራ የተደረገው ባዮቲንላይትድ ባለ ሙሉ ርዝመት DARS-AS1 ወይም የተቆረጠ (ከላይ) በመጠቀም ነው።Immunoblot PACT መቀበልን ያሳያል (ከታች)።ኤፍ የተጣራ ባንዲራ PACT በባዮቲኒላድ ባለ ሙሉ ርዝመት DARS-AS1 ወይም የተቆረጠ (እንደ e) ለ in vitro RIP assay።የወጣው አር ኤን ኤ በ RT-qPCR ተረጋግጧል።g ለPACT የተለያዩ አር ኤን ኤ ቁርጥራጮች አንጻራዊ ቅርበት የተገኘው ባዮላይየር ኢንተርፌሮሜትሪ በመጠቀም ነው።ለመተንተን, 100 nM RNA እና 1 μM RAST ጥቅም ላይ ውለዋል.h In vitro RIP ምርመራዎች የተጣራ ያልተነካ ወይም የተቆራረጡ PACT በመጠቀም ተካሂደዋል።የወጣው አር ኤን ኤ በ RT-qPCR ተረጋግጧል።DARS-AS1ን፣ PACTን፣ ወይም ሁለቱንም ከመጠን በላይ የሚጨምሩት የSW620 ሴሎች የእድገት መጠን።በ SW620 ህዋሶች ውስጥ ባለ ሙሉ ርዝመት ወይም የተቆረጠ DARS-AS1 ከመጠን በላይ መግለጽ በህዋስ እድገት ላይ የተለያየ ተጽእኖ ነበረው።k አፖፕቶሲስ በፀረ-PARP ፀረ እንግዳ አካላት የበሽታ መከላከያ ዘዴ ተገኝቷል።l የ DARS-AS1 ንክኪ በፍሰት ሳይቶሜትሪ እንደሚታየው የ SW620 ሕዋሳት አፖፕቶሲስን ያስከትላል።የሚታየው መረጃ የሶስት ሙከራዎች አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ነው። *p ≤ 0.05፣ **p ≤ 0.01፣ ***p ≤ 0.001፣ ****p <0.0001፣ በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ ፈተና። *p ≤ 0.05፣ **p ≤ 0.01፣ ***p ≤ 0.001፣ ****p <0.0001፣ በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ ፈተና። * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05፣ **p ≤ 0.01፣ ***p ≤ 0.001፣ ****p <0.0001 በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና። * ገጽ ≤ 0.05፣ ** ገጽ ≤ 0.01፣ *** ገጽ ≤ 0.001፣ ****p <0.0001፣通过双尾学生t 检验。 * ገጽ ≤ 0.05፣ ** ገጽ ≤ 0.01፣ *** ገጽ ≤ 0.001፣ ****p <0.0001፣通过双尾学生t 检验。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05፣ **p ≤ 0.01፣ ***p ≤ 0.001፣ ****p <0.0001 በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና።
ከዚያም ለPACT ማህበር የሚያስፈልገውን የ DARS-AS1 ክልልን ለመለየት ሶስት ባዮቲንላይድድ DARS-AS1 አር ኤን ኤ ቁርጥራጮችን በብልቃጥ ግልባጭ ፈጥረናል (ምስል 3e)።የአር ኤን ኤ ትንተና ውጤቶቹ እንደሚያሳየው እያንዳንዱ ክፍልፋዮች ከPACT ጋር መስተጋብር መፍጠር ችለዋል፣ ነገር ግን የ3′-ተርሚናል ክልል (384-768 ኑክሊዮታይድ የተሰየመ A3) ከ1-384 ኑክሊዮታይዶች A1) (ምስል 3e) አሳይቷል።ተመሳሳይ ውጤቶች በብልቃጥ RIP ጥናት ውስጥ ዳግመኛ PACT (ምስል 3 ረ) በመጠቀም ተስተውለዋል።ከነዚህ ውጤቶች ጋር በሚስማማ መልኩ BLIን በመጠቀም የማይንቀሳቀሱ አር ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ከ PACT ጋር ለማገናኘት የተደረጉ ሙከራዎች በተጨማሪ PACT ለ A3 (384-768 nt) (KD ዋጋ በግምት 94.6 nM) ከፍ ያለ ግንኙነት እንዳለው አሳይቷል፣ ከሌሎች አካባቢዎች ጋር ምንም ግንኙነት የለውም ማለት ይቻላል።(ምስል 3 መ)
እንዲሁም በPACT ውስጥ ተያያዥ የሆኑትን አስገዳጅ ክልሎች መርምረናል።PACT ሶስት ተግባራዊ ጎራዎችን ይዟል፣ ሁለቱ የተጠበቁ ባለ ሁለት መስመር አር ኤን ኤ ማሰሪያ ጎራዎች (dsRBD) እና ሶስተኛው ጎራ (የተሰየመ D3) እንደ ፕሮቲን መስተጋብር የሚያንቀሳቅስ ነው።የእያንዳንዱን ጎራ የ lncRNA ማሰሪያ አቅምን ለመመርመር፣ እያንዳንዱን ሶስት ጎራዎች ያስወገዱ እና የ in vitro RIP assay ያደረጉ ሶስት ሚውቴሽን ፈጠርን።ውጤታችን እንደሚያሳየው የ PACT ሶስተኛው ጎራ (D3) መሰረዙ ከ DARS-AS1 ጋር ያለውን ግንኙነት በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሶታል (ከ 0.11 እጥፍ ባልተጠበቀ PACT ጋር ሲነፃፀር) ከሌሎቹ ሁለት ሚውቴሽን (ምስል 3h) ጋር ሲነፃፀር መለቀቅ ታይቷል ። የD3 ከ DARS ጋር ተገናኝቷል።-AC1.እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው፣ በDARS-AS1 እና PACT መካከል ያለው መስተጋብር በዋናነት በDARS-AS1 3′ መጨረሻ እና በPACT D3 ጎራ በኩል ሊከሰት እንደሚችል ይጠቁማሉ።
DARS-AS1 በ PACT አገላለጽ ላይ ምንም ተጽእኖ እንደሌለው እና PACT በ DARS-AS1 ላይ ምንም ተጽእኖ እንደሌለው አስተውለናል (ተጨማሪ ምስል 3 ሐ)።ከዚያም PACT መውደቅ በሴል እድገት ላይ ያለውን ተጽእኖ መርምረናል።ከDARS-AS1 በተቃራኒ፣ PACT ሲወድቅ አንጻራዊ ህዋሶች ከ1.5-3 እጥፍ በፍጥነት አድገዋል (ተጨማሪ ምስል 3d)።የቅኝ ግዛት አፈጣጠር ውጤት እንደሚያመለክተው ህዋሳቱ ከ SHRNA ህክምና በኋላ ከ2-3 እጥፍ ቅኝ ግዛቶችን ከ PACT (ተጨማሪ ምስል 3e) ጋር ይመሰርታሉ።DARS-AS1 በPACT በኩል የሕዋስ መስፋፋትን ይቆጣጠር እንደሆነ ለመፈተሽ PACT፣ DARS-AS1 ወይም ሁለቱንም ከመጠን በላይ የሚጨምሩ SW620 ህዋሶችን ፈጥረናል።የ PACT ከመጠን በላይ መገለጽ የሕዋስ መስፋፋትን መከልከልን ያሳያል (ምስል 3i)።DARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨመር የሕዋስ መስፋፋትን በእጅጉ ቢያበረታታም፣ DARS-AS1 እና PACTን ከመጠን በላይ የሚጨምሩት የሴሎች እድገት ላይ ምንም ልዩ ልዩነት የለም።እነዚህ ውጤቶች PACT በDARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨናነቅ ያስከተለውን የጨመረው መስፋፋት ሊከላከል እንደሚችል ይጠቁማሉ።
የተለያዩ የ DARS-AS1 ክልሎች የተለያዩ PACT-የማስተሳሰር ችሎታዎች ስላላቸው፣ በተለያዩ የ DARS-AS1 ፍርስራሾች ከመጠን በላይ በመግለፅ በሴሎች መስፋፋት ላይ ያላቸውን አንጻራዊ ተጽእኖ መርምረናል።ከሌሎቹ ሁለት ቁርጥራጮች ጋር ሲነጻጸር, DARS-AS1 በ 3′ መጨረሻ (384-768 nt) ላይ ከመጠን በላይ ተጨምሯል, በ DARS-AS1 ውስጥ ያለው ዋናው ከPACT ጋር የተያያዘ ክልል, እሱም የሕዋስ መስፋፋትን ለማነቃቃት ከፍተኛ ችሎታ ያለው (ምስል 3j).እነዚህ ውጤቶች በ DARS-AS1 አስገዳጅ አቅም እና ባዮሎጂካል ተግባር መካከል ያለውን አወንታዊ ግንኙነት ያመለክታሉ።
PACT ፕሮ-አፖፖቲክ ፕሮቲን እንደሆነ ተዘግቧል19.ስለዚህ, የ DARS-AS1 በአፖፕቶሲስ ላይ ያለውን ተጽእኖ መርምረናል.እንደተጠበቀው፣ DARS-AS1 knockdown በ SW620 ሕዋሳት ውስጥ የ PARP መቆራረጥን በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል እና በ SW620፣ HCT116፣ HepG2 እና MBA-MD-231 ሕዋስ መስመሮች (ምስል 3k) ውስጥ የተካተቱትን ቪ-አዎንታዊ ሴሎችን መጠን ጨምሯል።3)3f–h)፣ የ DARS-AS1 በካንሰር ሕዋሳት ውስጥ ያለው ፀረ-አፖፖቲክ ተጽእኖ ከPACT አፖፕቶሲስ አበረታች ተግባር ጋር ተቃራኒ መሆኑን ያሳያል።እነዚህ ውጤቶች ሲደመሩ የDARS-AS1 ኦንኮጅኒክ ተግባር የPACT ተግባርን በመከልከል ሊሆን እንደሚችል ይጠቁማሉ።
በመቀጠል፣ የDARS-AS1-PACT ማህበርን ተግባራዊ እንድምታ መርምረናል።PACT በቀጥታ መስተጋብር PKRን እንደሚያንቀሳቅስ ተዘግቧል፣ይህም በመቀጠል eIF2α phosphorylation እንዲጨምር፣ የትርጉም መሰረዝ እና አፖፕቶሲስ17።በመጀመሪያ፣ DARS-AS1 የPACT እና PKR ሴሉላር አካባቢ ላይ ተጽዕኖ ያሳርፈው እንደሆነ መርምረናል።Confocal fluorescence ማይክሮስኮፒ እንደሚያሳየው PACT እና PKR በ SW620 ሴሎች ውስጥ በአማካኝ የፒርሰን ቁርኝት ኮፊሸን 0.72 በከፍተኛ ደረጃ ተቀይረዋል።ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ DARS-AS1 ከመጠን በላይ መገለጽ የPACT እና የPKR የጋራ መገኛን በእጅጉ ቀንሷል (አማካኝ የፒርሰን ትስስር ኮፊሸን 0.61) (ምስል 4a)።DARS-AS1 የPACT-PKR መስተጋብርን ማስተካከል ይችል እንደሆነ ለመመርመር፣ በSW620 cell lysates ውስጥ ከፀረ-PACT ፀረ እንግዳ አካላት ጋር የተቀናጀ የበሽታ መከላከያ (የጋራ IP) ምርመራን አደረግን።PKR በቁጥጥር ሴሎች ውስጥ በፀረ-PACT ውስጥ በጣም የበለፀገ ሲሆን የ PKR መልሶ ማግኘቱ DARS-AS1 (ምስል 4b) ከመጠን በላይ ከሚወጡት ሴሎች ውስጥ በሊዛዎች ውስጥ በእጅጉ ቀንሷል።የተጣራ PACT እና PKR ለ in vitro ፕሮቲን ማሰሪያ ሙከራዎች ጥቅም ላይ ውለዋል።በዚህ መሰረት፣ DARS-AS1ን የሰጡት ግን ምንም ቁጥጥር ያልተደረገላቸው አር ኤን ኤ የታፈነ የPACT-PKR መስተጋብር አሳይተዋል (ምስል 4c)።ሁሉም ውጤቶች እንደሚያሳዩት DARS-AS1 PACT እና PKR ግንኙነትን አቋረጠ።
የ PACT እና PKR ቁጥጥር ህዋሶች ወይም DARS-AS1ን ከመጠን በላይ የሚጨምሩ ህዋሶች የጋራ መገኛ confocal fluorescence ማይክሮስኮፒ በመጠቀም ተስተውሏል።አስኳሎቹ በDAPI ተበክለዋል።የስታቲስቲክስ ውጤቶች ከ 16 ፎቶግራፎች ተገኝተዋል.b Co-immunoprecipitation (co-IP) ፀረ-PACT ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም ቁጥጥር SW620 ሕዋሳት ወይም ሕዋሳት DARS-AS1 ከመጠን ያለፈ.c የተሰየመው PACT፣ የተጣራ PKR እና በብልቃጥ የተገለበጠው ከDARS-AS1 ወይም mock RNA ጋር በብልቃጥ ፕሮቲን ማሰሪያ ትንተና እንዲፈጠር ተደርጓል።ፀረ-ባንዲራ ፀረ እንግዳ አካላት ለበሽታ መከላከያነት ጥቅም ላይ ውለዋል.d Immunoblots ከተጠቆሙት ፀረ እንግዳ አካላት ጋር በ SW620 እና HCT116 ሴሎች ከቁጥጥር shRNA ወይም DARS-AS1-shRNA ጋር ተላልፈዋል ከዚያም የሴረም ረሃብ.ሠ DARS-AS1 አገላለጽ ደረጃዎች ለ thapsigargin ሴሉላር ትብነት ተለውጠዋል።SW620 ህዋሶች በDARS-AS1 shRNA፣ DARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨናነቅ ፕላዝማይድ ወይም መቆጣጠሪያ ፕላዝሚድ ተለውጠዋል።ሴሎች ለ48 ሰአታት በthapsigargin ታክመዋል እና የሕዋስ አዋጭነት የሚወሰነው MTS reagentን በመጠቀም ነው።f በብልቃጥ የተገለበጠ DARS-AS1 ወይም dummy አር ኤን ኤ እና የተጣራ PACT በብልቃጥ አግብር ምርመራ እና የበሽታ መከላከያ ምርመራ ለማድረግ ጥቅም ላይ ውለዋል።g እነዚህን ፀረ እንግዳ አካላት በመጠቀም Immunoblots በ SW620-ctrl ሕዋሳት (በግራ) ወይም በ PKR ሚውቴሽን (በቀኝ) ላይ ከመጠን በላይ የሚጨምሩ ሴሎች ላይ ተካሂደዋል.እነዚህ ሴሎች በቁጥጥር shRNA ወይም DARS-AS1-shRNA ተለውጠዋል ከዚያም የሴረም ረሃብ.h ፍሰት ሳይቶሜትሪ የሚውቴሽን PKR አለማግበር በ SW620 ሕዋሳት ውስጥ ለDARS-AS1-አፖፕቶሲስ ማካካሻ መሆኑን አሳይቷል።i Immunoblots ከተጠቆሙት ፀረ እንግዳ አካላት ጋር በ SW620 (በግራ) ወይም በ HCT116 (በቀኝ) ሴሎች ውስጥ ተካሂደዋል.ከቁጥጥር shRNA ወይም DARS-AS1 shRNA ጋር የተለወጡ ህዋሶች ሴረም የተከለከሉ እና በ100 nM PKR C16 inhibitor ወይም DMSO የተጨመሩ ናቸው።የመጠን አሞሌ = 5µmየሚታየው መረጃ የሶስት ሙከራዎች አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ነው።* p ≤ 0.05 ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና።
በአጠቃላይ አንድ ጊዜ PACT ከPKR17 ጋር መስተጋብር ሲፈጥር፣ በ Thr451 ላይ ያለው PKR phosphorylation ሊነሳሳ እንደሚችል ይታመናል።ውጤታችን እንደሚያመለክተው የ PKR phosphorylation ደረጃ ከሴረም ረሃብ በኋላ በ DARS-AS1 ተንኳኳ ህዋሶች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ከፍ ያለ ነበር (ምስል 4d እና ተጨማሪ ምስል 4 ሀ)።በዚህ መሠረት፣ የ eIF2α፣ ዋናው የPKR ንኡስ ክፍል ፎስፈረስላይዜሽን እንዲሁ በDARS-AS1 shRNA (ምስል 4d እና ተጨማሪ ምስል 4a) በከፍተኛ ሁኔታ መጨመሩን ደርሰንበታል።Thapsigargin ER Ca2+ እንዲለቀቅ የሚያደርግ የኤአር ጭንቀት ነው።ከ thapsigargin ጋር የሚደረግ ሕክምና የ PACT አገላለጽ እና ማግበርን እንደሚያበረታታ ሪፖርት ተደርጓል, ይህም ከ PKR ጋር የበለጠ መስተጋብር ይፈጥራል እና ይሠራል, ይህም eIF2a phosphorylation 18,61 በመጨመር አፖፕቶሲስን ያመጣል.እዚህ፣ DARS-AS1 የPACT/PKR መንገዱን በመከልከል ህዋሶች ውጥረትን እንዲያሸንፉ መርዳት ይችል እንደሆነ ለመመርመር thapsigarginን እንደ PACT/PKR መንገድ ማነቃቂያ ተጠቀምን።የ DARS-AS1 አገላለጽ ደረጃ ከ thapsigargin ሕዋሳት መቋቋም ጋር በአዎንታዊ መልኩ የተቆራኘ መሆኑን ተመልክተናል።SW620 ህዋሶች DARS-AS1ን ከመጠን በላይ የሚጨምሩ ህዋሶች thapsigargin ሲታከሙ በተሻለ ሁኔታ ተርፈዋል፣ DARS-AS1 knockdown ያላቸው ህዋሶች የበለጠ ተጋላጭ ሆኑ (ምስል 4e)።ከነዚህ ውጤቶች ጋር በሚስማማ መልኩ, DARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨመር የ thapsigargin-induced PKR phosphorylation (ተጨማሪ ምስል 4 ለ) ቀንሷል.በተቃራኒው, ከ thapsigargin ህክምና በኋላ, PKR እና eIF2a ከቁጥጥር ሴሎች ጋር ሲነፃፀር በ DARS-AS1 ተንኳኳ ህዋሶች ውስጥ ፎስፈረስላይት ከፍ ​​ያለ መጠን ተወስደዋል (ተጨማሪ ምስል 4 ለ).የሚገርመው፣ thapsigargin የ DARS-AS1 አገላለጽ በመጠን-ጥገኛ አነሳስቷል፣ይህም የ DARS-AS1 ፀረ-ጭንቀት ተግባርን ሊያመለክት ይችላል (ተጨማሪ ምስል 4c)።በተጨማሪም፣ እነዚህን ምልከታዎች ለማረጋገጥ የ in vitro activation assays አድርገናል።ባጭሩ፣ PKR ፀረ-PKR ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም ከሴሎች lysates ተጠርጓል፣ ከዚያም በእንደገና PACT እና DARS-AS1 በብልቃጥ ተገለበጠ።ከኤንዛይም ምላሽ በኋላ, ፎስፎ-PKR WB በመጠቀም ተገኝቷል.ውጤታችን እንደሚያመለክተው PKR phosphorylation በከፍተኛ ሁኔታ በDARS-AS1 ታግዷል፣ ነገር ግን በቁጥጥር አር ኤን ኤ አይደለም (ምስል 4f)።እነዚህ በብልቃጥ እና በሰውነት ውስጥ ያሉ ውጤቶች እንደሚጠቁሙት DARS-AS1 በPACT-መካከለኛ PKR ማግበርን ይከለክላል።በተመሳሳይ ጊዜ, በ DARS-AS1 (ምስል 4f) ውስጥ የ PACT መልሶ ማግኛን መቀነስ ተመልክተናል.ይህ ውጤት ከኢን ቪትሮ ፕሮቲን ትስስር ምርመራ ውጤት (ስእል 4 ሐ) ጋር የሚጣጣም ነው እና የ DARS-AS1 ለPACT-PKR ማህበር የማገድ ተግባርን በድጋሚ ያሳያል።
በሴሉላር ውጥረት ውስጥ ለPKR ማግበር በPACT D3 ጎራ ውስጥ Ser246 እና Ser287 ያስፈልጋሉ።ሁለት የሴሪን ቅሪቶችን በአላኒን መተካት ሚውታንት PACT (mutD) ሰጠ፣ ይህም ውጥረት በሌለበት ጊዜ PKR ን ነቅቷል እና በአላኒን (mutA) መተካት ፕሮቶኮሉን ቀይሮታል።የዚህን ጎራ አስፈላጊነት ከDARS-AS1 ጋር በቀጥታ በማያያዝ ስላሳየን፣እነዚህ ቀሪዎች ከDARS-AS1 ጋር መስተጋብር መፍጠር ይችሉ እንደሆነ ለመፈተሽ እነዚህን ሁለት PACT ሚውታንቶች ፈጥረናል።የሚገርመው፣ ሁለቱም ሚውታንቶች ከDARS-AS1 (ተጨማሪ ምስል 4ዲ) ጋር የመተሳሰር አቅማቸውን አጥተዋል፣ ይህም የPACT ፕሮቲን ሙሉ መዋቅር ከDARS-AS1 ጋር ቀልጣፋ መስተጋብር ሊያስፈልግ እንደሚችል ይጠቁማል።
በተጨማሪም፣ ውጤቶቻችን እንደሚጠቁሙት በ DARS-AS1-shRNA-induced inhibition of cell proliferation (PACTmutA) overexpressing (PACTmutA) ወይም dominant negative PKR mutant (PKRmut) (ተጨማሪ ምስል 4e. e) በከፊል ወደነበረበት መመለስ ይቻላል።የበላይ-አሉታዊ የPKR ሚውቴሽን ከመጠን በላይ መገለጽ በDARS-AS1 knockdown እና በ eIF2a phosphorylation በሴረም-የተራቀቁ ህዋሶች (ምስል 4ግ) የተፈጠረውን PKR phosphorylation ቀንሷል።በይበልጥ፣ በDARS-AS1 knockdown የተነሳሱት የአፖፕቶቲክ ሴሎች መጠን PKRmut ከመጠን በላይ በሚጨምሩ ሴሎች ውስጥ ቀንሷል (ምስል 4h እና ተጨማሪ ምስል 4 ግ)።የPKR kinase እንቅስቃሴን መከልከል የDARS-AS1 ተግባርን ይጎዳል ምክንያቱም ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት DARS-AS1 knockdown PKR እና eIF2a phosphorylation ህዋሶች በPKR-ተኮር C16 inhibitor ሲታከሙ (ምስል 4i እና ተጨማሪ ምስል 4h) እምብዛም አያነሳሱም።).አንድ ላይ ሲደመር፣ ውጤቶቻችን እንደሚጠቁሙት DARS-AS1 በPACT-mediated PKR ማግበርን በመከልከል ቢያንስ በከፊል የሕዋስ መስፋፋትን ያበረታታል።
የ DARS-AS1ን በቲዩሪጄኔሲስ ውስጥ ያለውን ሚና የበለጠ ለመዳሰስ የመዳፊት xenograft ሞዴልን በመጠቀም በ Vivo ሙከራዎች ውስጥ አድርገናል። ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት የDARS-AS1 መውደቅ በአይጦች ላይ ዕጢ እድገትን በእጅጉ ቀንሷል (p value <0.0001) (ምስል 5a)። ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት የDARS-AS1 መውደቅ በአይጦች ላይ ዕጢ እድገትን በእጅጉ ቀንሷል (p value <0.0001) (ምስል 5a)። Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት DARS-AS1 መውደቅ በአይጦች ላይ ዕጢ እድገትን በእጅጉ ይቀንሳል (p value <0.0001) (ምስል 5a)።结果表明， ዳርስ-AS1结果表明，ዳርስ-AS1 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት DARS-AS1 መውደቅ በአይጦች (p value <0.0001) (ምስል 5a) ላይ ያለውን የዕጢ እድገት በእጅጉ ቀንሷል።ስለዚህ፣ በ DARS-AS1 knockdown ቡድን ውስጥ፣ አማካይ እጢ መጠን በ72.9 በመቶ ገደማ እና አማካኝ እጢ ብዛት በ87.8 በመቶ ቀንሷል (ምስል 5b-d)።እነዚህ ውጤቶች DARS-AS1 በ Vivo ውስጥ የእጢ እድገትን በእጅጉ ሊያበረታታ እንደሚችል አጥብቀው ይጠቁማሉ።
ማስታወቂያ DARS-AS1 እርቃናቸውን አይጥ ላይ ባሉ ኮሎሬክታል ኦንኮጄኔሲስ ላይ የሚያስከትለው ውጤት።የእድገት ኩርባዎች (ሀ)፣ የእጢ መጠን (ለ)፣ ክብደት (ሐ) እና ዕጢ ምስሎች (መ) ይታያሉ።የስህተት አሞሌዎች ±SEMን ይወክላሉ። n = 10. ****p <0.0001፣ በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ ፈተና። n = 10. ****p <0.0001፣ በሁለት ጭራ የተማሪ ቲ ፈተና። n = 10. ****p <0,0001 по двусторонему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና።n = 10. ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двусторонему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ፈተና።e ካፕላን-ሜየር በ DARS-AS1 የገለፃ ደረጃዎች እና በUVM፣ KICH፣ KIRP፣ MESO፣ GBM እና LGG በሽተኞች አጠቃላይ ህልውና መካከል ያለውን ትስስር ተንትኗል።በታካሚዎች ውስጥ ከፍተኛ መጠን ያለው የ DARS-AS1 መግለጫ በከፍተኛው 50% ውስጥ ነበር.በታካሚዎች ውስጥ ያለው የ DARS-AS1 አገላለጽ ዝቅተኛ ደረጃ ከ 50% በታች ነው.p-values ​​የሚወሰኑት የምዝግብ ማስታወሻ ደረጃን በመጠቀም ነው።f DARS-AS1 የPACT-PKR መንገድን እና የእጢ እድገትን የሚቆጣጠርበት የታቀደ ሞዴል።
የ DARS-AS1 ክሊኒካዊ ተፅእኖ የበለጠ ለመረዳት በገለፃው እና በታካሚ ሕልውና መካከል ያለውን ግንኙነት መርምረናል።የTCGA ዳታ ስብስብን በመተንተን ከፍ ያለ የ DARS-AS1 አገላለጽ ከ uveal melanoma (UVM)፣ የኩላሊት ክሮሞፎቢያ (KICH)፣ የኩላሊት ፓፒላሪ ሴል ካርስኖማ (KIRP)፣ ሜሶቴሊዮማ (MESO)፣ multiplex ጋር የተቆራኘ መሆኑን አግኝተናል።ዝቅተኛ ሕልውና ከ glioblastoma morphosis (ጂቢኤም) እና ዝቅተኛ ደረጃ የአንጎል ግሊኦማ (LGG) ሕመምተኞች ጋር በእጅጉ የተያያዘ ነበር (ምስል 5e).እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት DARS-AS1 በክሊኒካዊ ዕጢ እድገት ውስጥ ትልቅ ሚና ሊጫወት ይችላል እና በብዙ ነቀርሳዎች ውስጥ ሊተነብይ የሚችል ባዮማርከር ሊሆን ይችላል።
በዚህ ጥናት ውስጥ፣ መጠነ ሰፊ የ CRISPRi ተግባራዊ ምርመራን በመጠቀም፣ DARS-AS1 lncRNA ሁለት ቁልፍ የጭንቀት ምላሽ ሰጪዎችን PACT እና PKRን በመቆጣጠር የካንሰር ሕዋስ ጭንቀትን እንደሚያሸንፍ ወስነናል።ከPACT ጋር በቀጥታ በመገናኘት፣ DARS-AS1 በPACT-mediated PKR ማግበርን አግዷል፣በዚህም የአፖፖቲክ ሴል ሞትን ይከላከላል እና የሕዋስ መስፋፋትን ያበረታታል (ምስል 5f)።የ DARS-AS1 ን ማሻሻል በበርካታ የካንሰር ዓይነቶች ውስጥ ታይቷል, ይህም በአስጨናቂ ሁኔታዎች ውስጥ የካንሰር ህዋሶችን መትረፍን የማስፋፋት ተግባሩ ለብዙ የካንሰር ዓይነቶች በስፋት ሊተገበር እንደሚችል ይጠቁማል.
PACT እንደ PKR ገቢር ፕሮቲን ተለይቷል፣ እና በPACT-መካከለኛ PKR ማግበር ግልባጭን፣ ትርጉምን፣ አፖፕቶሲስን እና ሌሎች አስፈላጊ ሴሉላር ሂደቶችን62 በመቆጣጠር በውጥረት ምላሾች ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታል።ለብዙ አሥርተ ዓመታት፣ የPACT-PKR ካስኬድ ካንሰር-ተኮር ደንብን ለመረዳት ተሞክሯል።እዚህ ላይ፣ ጥናታችን በሴሉላር lncRNA DARS-AS1 በካንሰር ሴሎች ውስጥ ያለውን PACT-PKR የመቆጣጠር ዘዴን ገልጿል፣ይህም በቀጥታ ከPACT ጋር የሚገናኝ፣የPACT-PKR መስተጋብርን የሚያግድ፣የ PKR ገቢርን እና eIF2α phosphorylationን የሚከለክል፣በዚህም በውጥረት የሚፈጠር አፖፕቶሲስን ይከላከላል። ቀስቃሽ ውሎ አድሮ የካንሰር መስፋፋት.ሴሎች.ይህ ግኝት የካንሰር ትንበያ እና ህክምና ሊሆኑ የሚችሉ lncRNA ዒላማዎች ላይ ብርሃን ይፈጥራል።
የእኛ መረጃ እንደሚያሳየው DARS-AS1 knockdown ፎስፈረስላይትድ PKR እና eIF2α በከፍተኛ መጠን በመጨመር ሴሎችን ወደ ሴረም ረሃብ ያነቃል።እነዚህ ውጤቶች እንደሚጠቁሙት DARS-AS1 የPACT/PKR እንቅስቃሴን በመከልከል በአስቸጋሪ ሁኔታዎች ውስጥ የካንሰር ሕዋሳትን መትረፍ እንደሚያበረታታ ይጠቁማሉ።እንደ ASPACT እና nc886 ያሉ ሌሎች ኮድ የማይሰጡ አር ኤን ኤዎች በPACT/PKR ዘንግ ላይ PACT48 mRNAን በመቀነስ ወይም ከPKR49,50,64 ጋር በማስተሳሰር አውቶፎስፈረስን በመቆጣጠር ይሳተፋሉ።ከነሱ መካከል፣ DARS-AS1 የPACT-PKR ማህበርን እንደ ረብሻ ይሠራል።ይህ ጥናት ስለ PACT/PKR ዘንግ ደንብ እና የ lncRNAs በጭንቀት ምላሾች ውስጥ ያለውን ሚና ግንዛቤያችንን ያበለጽጋል።
PACT ሶስት የተለያዩ ጎራዎችን ይዟል።እያንዳንዱ የመጀመሪያዎቹ ሁለት dsRBDs PACT ከPKR ጋር ከፍተኛ ትስስርን ለማግኘት በቂ ነው፣ ሶስተኛው ጎራ (D3) ደግሞ PKR in vitro እና in vivo ያስፈልጋል።ጥናታችን እንደሚያሳየው DARS-AS1 ከ D3 ጎራ (ምስል 3 ሰ) ጋር መስተጋብር እንደሚፈጥር አሳይቷል።የ lncRNA (768 ኑክሊዮታይዶች) ትልቅ መጠን ከተሰጠው፣ DARS-AS1 ከ D3 ጋር ማገናኘት በ dsRBD እና PKR PACT ጎራ መካከል ያለውን መስተጋብር በአካል በመግታት የPACT እና PKR ግንኙነትን ያግዳል።የ PACT ነጥብ ሚውቴሽን Ser246 እና Ser287ን በD3 ውስጥ በአላኒን ወይም አስፓርትሬት የተካው ለ DARS-AS1 ያለውን ትስስር አቋረጠ፣ ይህም የD3 አጠቃላይ መዋቅራዊ እና ኤሌክትሪክ ንብረቶች በማህበራቸው ውስጥ ያለውን ጠቀሜታ አመልክቷል።የበለጠ ትክክለኛ የባዮኬሚካላዊ ትንተና እና ከፍተኛ ጥራት ያለው የPACT መዋቅራዊ ትንተና በመጠቀም ወደፊት የዚህ ዘዴ ተጨማሪ ዝርዝሮች ያስፈልጋሉ።
ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች DARS-AS1 በበርካታ ስልቶች ሴል ማባዛትን እንደሚያበረታታ ዘግበዋል51,52,53.በአንድ ምሳሌ ውስጥ፣ መርማሪዎች DARS-AS1 በኩላሊት ካንሰር ሴሎች ውስጥ ሚፒ-194-5p ላይ በማነጣጠር አንቲሴንስ ፕሮቲን ኢንኮዲንግ የ DARS ጂንን እንደተሻሻለ ተመልክተዋል።ነገር ግን፣ በዚህ ጥናት ውስጥ፣ DARS-AS1 knockdown በትንሹ የኮሎሬክታል፣ የጡት እና የጉበት ካንሰሮችን ጨምሮ በበርካታ የካንሰር ዓይነቶች በDARS ቅጂ ላይ ትንሽ ተጽእኖ አላሳደረም።lncRNAs የሕዋስ እና ቲሹ-ተኮር አገላለጽ ዘይቤዎችን ስለሚያሳዩ በሁሉም የካንሰር ዓይነቶች ላይ የተግባር ስልቶች ሊጠበቁ አይችሉም፣ይህም በእኛ ምልከታ እና በተለያዩ ካንሰሮች ቀደም ባሉት ግምገማዎች መካከል ላለው ልዩነት አስተዋፅዖ ያደርጋል።የተለያዩ የፊዚዮሎጂ እና የስነ-ሕመም ሂደቶችን ልዩ ዘዴዎችን ለማብራራት ልዩ ጥናቶች ያስፈልጋሉ.
የክሊኒካዊ መረጃ ትንተና እንደሚያሳየው የ DARS-AS1 እብጠቶች በካንሰር ህመምተኞች መዳን ላይ በተቃራኒው የ DARS-AS1 / PACT / PKR ዘንግ በካንሰር ትንበያ ውስጥ ያለውን ጠቀሜታ የሚያጎላ ነው.በማጠቃለያው፣ ጥናታችን እንደሚያሳየው DARS-AS1 የ PACT/PKR ምልክት ማድረጊያ ዘንግ ተቆጣጣሪ፣ የካንሰር ህዋሶች መስፋፋትን እንደሚያበረታታ እና በውጥረት ምላሽ ጊዜ አፖፕቶሲስን የሚገታ ሲሆን ይህም ሌላ የምርምር መስመር የሚሰጥ እና ወደፊት ሊደረጉ የሚችሉ ህክምናዎች ላይ ምርምር ለማድረግ ፍላጎት እንዳለው ያሳያል። .
የሰው ሴል መስመሮች SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 እና HEK293T የተገኙት በቻይና ካለው ብሔራዊ የሕዋስ መስመር ምንጭ መሠረተ ልማት ነው።ሁሉም ሴሎች በ DMEM መካከለኛ (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) በ 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) እና 1% ፔኒሲሊን-ስትሬፕቶማይሲን (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) በ 37 ° C, 5% CO2 ተጨምረዋል.ኢንኩቤተር.
ፀረ-PACT, Abcam (ab31967);ፀረ-PKR, Abcam (ab184257);ፀረ-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);ፀረ-ባንዲራ, Abcam (ab125243);ፀረ-eIF2α, Abcam (A0764));ፀረ-eIF2a (phosphorus S51), Abcam (ab32157);ፀረ-PACT (ፎስፈረስ S246), Abgent (AP7744b);ፀረ-β-tubulin, CST (2128);መደበኛ መዳፊት IgG, CST (5415S);መደበኛ ጥንቸል IgG, CST (2729S).ፀረ እንግዳ አካላት በPBST 1፡1000 ለምዕራቡ መጥፋት እና 1፡100 ለአይ.ፒ.
sgRNAs የተሰራው CRISPR-ERA66 በተባለ በይፋ የሚገኝ መሳሪያ ነው።ለ sgRNA ልማት ነባሪውን የመሳሪያ መለኪያዎች እና አልጎሪዝም በ 3 ኪባ ክልል ውስጥ የ sgRNA ማያያዣ ጣቢያዎችን ተጠቀምን።በ TSS ላይ ያተኮረ.የsgRNA oligonucleotides ገንዳዎች በ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) የተዋሃዱ እና ወደ ሰው ሰራሽ የፒጂአርኤንኤ ፕላዝማይድ (Addgene #44248) ተቀይረዋል።በድምሩ 12µg የተሰበሰበ ፒጂአርኤንኤ ፕላዝማይድ፣ 7.2µg psPAX2 (Addgene #12260) እና 4.8µg pMD2.G (Addgene #12259) ወደ 5 x 106 HEK293T በዲኤንኤ ትራንስፌክሽን ዲሽ በ10 ሴ.ሜ. ሴሎች (CWBIO, ቤጂንግ, ቻይና) የአምራቹን መመሪያ በመከተል.ቫይረሱ የያዙ ሱፐርናቴቶች ከተተላለፉ ከ48 እና 72 ሰአታት በኋላ ተሰብስበው በ0.45µm ማጣሪያ ተጣርተዋል።ለምርመራ፣ የdCas9/KRAB ውህደት ፕሮቲንን የሚገልጹ SW620 ሴሎች የተገኙት በቫይረስ መተላለፍ ነው።የተሻሻለው SW620 ሕዋሳት በአራት ገለልተኛ የኢንፌክሽን ሙከራዎች በMOI 0.1-0.3 እና በ2 μg/ml puromicin (Sigma, St. Louis, MO) ለ 2 ቀናት በቫይረሱ ​​ቤተ-መጽሐፍት ተበክለዋል.ከዚያ በኋላ፣ ህዋሶች ለ18 ቀናት በብልቃጥ ውስጥ እንዲለሙ ተደርገዋል፣ ለምርመራ በትንሹ 500 ህዋሶች/sgRNA ያለው የቤተመፃህፍት ሽፋን።
ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ የወጣው በ QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany, 51183) መመሪያ መሰረት ነው.በጥቅሉ፣ ቤተ መፃህፍቱን ለመገንባት በአንድ ባዮሎጂካል ተደጋጋሚ 100 μg ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ጥቅም ላይ ውሏል።የsgRNA ክልል በሁለት ዙር PCR ተጨምሯል እና ከባርኮድ ጋር ተገናኝቷል።
PCR ምርቶች NucleoSpin® ጄል እና PCR የመንጻት ኪት (MACHEREY-NAGEL, Düren, ጀርመን; 740609.250) እና Qubit™ HS ድርብ-ክር የዲኤንኤ መፈለጊያ ኪት (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ, Q32854) በመጠቀም መጠናቸው ተነጻጽረዋል.
የ MTS ምርመራ የሕዋስ መስፋፋትን ለመለካት ጥቅም ላይ ውሏል.ህዋሶች በ96-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ በ2000 ሴል/ጉድጓድ መጀመሪያ ጥግግት ላይ ተዘርተዋል።አንጻራዊው የሴሎች ብዛት በተጠቀሰው ጊዜ በየቀኑ ከ4-6 ቀናት ይለካል።ለእያንዳንዱ ጉድጓድ, 20 μl MTS reagent (Promega) በ 100 μl ዲኤምኤም, በሴሎች ውስጥ ለ 4 ሰዓታት በ 37 ° ሴ, ከዚያም OD490 ተወስዷል.
ያልተቋረጠ የእድገት አቅም የተገኘው የሉል ቅርጾችን በመተንተን ነው.ባጭሩ፣ 2000 በ shRNA DARS-AS1 ወይም የቁጥጥር shRNA የተለወጡ ህዋሶች እጅግ በጣም ዝቅተኛ በሆነ ተያያዥ ማይክሮፕሌትስ (ኮርኒንግ) በየ 4 ቀኑ በመካከለኛ ለውጥ እንዲዳብሩ ተደርገዋል።ስፕሮይድስ ከ 14 ቀናት በኋላ ተቆጥረዋል.500 ህዋሶች ከ DARS-AS1 ከመጠን በላይ መጨመር ፕላዝሚድ ወይም የቁጥጥር ፕላዝሚድ የተለወጡ ህዋሶች ለማበልጸግ ሙከራ ጥቅም ላይ ውለዋል፣ አለበለዚያ ዘዴው አልተለወጠም።
አር ኤን ኤ በRiboprobe® Combination Systems (Promega P1440) መመሪያ መሰረት T7 RNA polymerase እና biotin-16-UTP (Roche 1138908910) በመጠቀም የተገለበጠ ነው።እዚህ ጥቅም ላይ የዋሉት ፕሪመርሮች በማሟያ ሠንጠረዥ 4 ውስጥ ተዘርዝረዋል.
የፕሮቲን ኮድ አድራጊ PACT ወይም PKR ክልሎች ወደ pET15b (Addgene #73619) ተዘግተው ወደ BL21(DE3) ተቀይረዋል።ባክቴሪያዎቹ በአምፒሲሊን በተዘጋጀው ኤልቢ ውስጥ በአንድ ጀንበር የተፈለፈሉ ሲሆን ከዚያም 100 እጥፍ በአዲስ LB ይቀባሉ።የመካከለኛው OD600 0.8 ሲደርስ የፕሮቲን አገላለፅን ለማነሳሳት 1 ሚሜ IPTG ተጨምሯል።ሌሊቱን ሙሉ ለስላሳ በሆነ መንቀጥቀጥ (250 ሩብ ደቂቃ በ20 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) ከታቀፉ በኋላ የሴሉ ፔሌት በሴንትሪፍግጅሽን (4000 ሩብ፣ 10 ደቂቃ፣ 4 ° ሴ) ተሰብስቧል።የሕዋሱን ፔሌት በሊሴስ ቋት (50 ሚሜ ትሪስ፣ ፒኤች 8.0፣ 250 ሚሜ ናሲኤል፣ 1 ሚሜ ፒኤምኤስኤፍ) እና በበረዶ ላይ ለ 30 ደቂቃዎች ቀቅለው፣ ከዚያም ሶኒኬት (15 ደቂቃ፣ 5 ሰ ማብራት/ማጥፋት፣ በበረዶ ላይ) እና ሴንትሪፉጅ (13,000) ራፒኤም)።, 30 ደቂቃ, 4 ° ሴ).ከዚያም በላይኛው በኒ-ኤንቲኤ ሬንጅ (QIAGEN) ላይ 3 ጊዜ በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ላይ ተጭኖ 4 ጊዜ በመታጠቢያ ቋት (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ታጥቦ 3 ጊዜ በድምሩ ከ 10 ሚሊ ሜትር ኤሊየንት ቋት (50 ሚሜ ትሪስ, ፒኤች 8.0, 250 ሚሜ ናሲል, 300 ሚሜ ኢሚዳዶል).የተጣራ ፕሮቲን የሚወሰነው ደብሊውቢን በመጠቀም ነው እና ትኩረቱ የሚወሰነው የኩቢት ፕሮቲን መመርመሪያ ኪት (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ Q 33212) በመጠቀም ነው።
የ RIP ምርመራዎች ቀደም ሲል እንደተገለፀው ከተሻሻሉ ጋር ተካሂደዋል.በአጭሩ፣ 1x RIP ቋት (25 ሚሜ ትሪ-ኤችኤልኤል፣ ፒኤች 7.5፣ 100 ሚሜ ናሲል፣ 0.5% NP-40፣ RNasin ribonuclease inhibitor (Promega)፣ PMSF (Beyotime Biotechnology)፣ 1 mM DDM፣ protease) ሊሴስ ሳይቶስታቲክ 1 x ኮክቴል (Roche, 1 mM DTT) እና ሴንትሪፉጅ በ 13,000 ራፒኤም ለ 15 ደቂቃ በ 4 ° ሴ.ከዚያ በላይ ያለው ንጥረ ነገር በፕሮቲን A+G መግነጢሳዊ ዶቃዎች (ሚሊፖሬ) ከ 5 μg ፀረ-PACT ፀረ እንግዳ አካላት (Abeam) ወይም IgG (CST) ጋር ተጣምሯል።ዶቃዎቹ በ 5x RIP ቋት 5 ጊዜ ታጥበዋል, ከዚያም በፕሮቲን ኬ (NEB) ተፈጭተዋል.አር ኤን ኤ በTrizol ተወጣ እና በ RT-qPCR ተወስኗል።ፕሪመርስ በማሟያ ሠንጠረዥ 5 ቀርቧል።
የ in vitro RIP ምርመራው የተካሄደው በተሻሻለው መደበኛ RIP አሴይ ፕሮቶኮል መሰረት ነው።በአጠቃላይ 5 pmol in vitro የተገለበጠ አር ኤን ኤ በ 1x በ RIP ቋት ተበረዘ እና በ 65°C ለ 5 ደቂቃዎች በማቀማቀዝ ተከልክሏል ከዚያም ወደ ክፍል የሙቀት መጠን ቀስ ብሎ ማቀዝቀዝ።በአጠቃላይ 5 pmol ያልተነካ ወይም የተቀየሩ ባንዲራ ምልክት የተደረገባቸው PACT ፕሮቲኖች ከኢ.ኮላይ ተጠርዘዋል።በተሻሻለው አር ኤን ኤ ለ 2 ሰአታት በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ይንከባከቡ እና ከላይ የተጠቀሰውን ሂደት ለፀረ-ባንዲራ IP ለ RIP ትንታኔ ይከተሉ።
ለአር ኤን ኤ ማራዘሚያ ትንተና፣ 1×107 ሕዋሳት በ1xRIP ቋት ተጥለዋል።በ 13,000 ራምፒኤም በ 15 ደቂቃ በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ በ 13,000 ሬልፔኖች ውስጥ ከተሰራ በኋላ, ከመጠን በላይ ፈሳሽ በ 30 μl streptavidin መግነጢሳዊ ዶቃዎች (ቤክማን) ለ 2 ሰዓታት በ 4 ° ሴ.የተጣራው ሊዛት ከእርሾ tRNA ጋር ቀረበ እና በ 40 ፒሞል የታደሰ አር ኤን ኤ በአንድ ጀንበር በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ተተክሏል ፣ ከዚያ ለሌላ 2 ሰዓታት እና 20 μl አዲስ የስትሬፕታቪዲን መግነጢሳዊ ዶቃዎች ከ BSA ጋር ተጨምረዋል።የማጠቢያው ደረጃ 4 ጊዜ ከ5x RIP ቋት እና 4 ጊዜ ከ1x RIP ቋት ጋር ያካትታል።ተጓዳኝ ፕሮቲኖች በባዮቲን ኢሊዩሽን ቋት (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) እና በ NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ተለያይተዋል.ከብር ቀለም በኋላ (በዮታይም ባዮቴክኖሎጂ) የተወሰኑ ባንዶች ተቆርጠው በኤም.ኤስ.
በPACT እና PKR መካከል ያለውን መስተጋብር ለመፈተሽ የ Co-IP ትንተና ተካሂዷል።ባጭሩ የሱፐርኔታንት ሊሳይቶች በ 1 x 107 lysed cells በ 1 x RIP buffer በመቀጠል ሴንትሪፍግሽን በ 13,000 ራፒኤም ለ 15 ደቂቃዎች በ 4 ° ሴ.ሊዛትስ በፕሮቲን A + G መግነጢሳዊ ዶቃዎች ተጭነዋል፣ ከ 5 μg ፀረ-PACT ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ተጣምረው እና በቀስታ በአንድ ሌሊት በ 4 ዲግሪ ሴልሺየስ ተሽከረከሩ።ዶቃዎቹ በ5×RIP ቋት 3 ጊዜ ታጥበዋል፣ሁለት ጊዜ በ1×RIP ቋት እና በ1×SDS ቋት ተለቅቀዋል።የተመለሰው ፕሮቲን በSDS-PAGE ጄል የተተነተነ እና በWB ተገኝቷል።
ሁለት pmol ባንዲራ ያለው PACT እና 1 pmol PKR ከኢ.ኮሊ ተጠርዘዋል።በ 1 × RIP ቋት ውስጥ ይቅፈሉት እና በ 10 ፒሞል የታደሰ አር ኤን ኤ ለ 2 ሰዓታት በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ይጨምሩ።ከዚያ በኋላ ለተጨማሪ ሁለት ሰአታት በፕሮቲን A+G መግነጢሳዊ ቢድ-የተጣመረ ፀረ-ተሰየመ ፀረ እንግዳ አካል ተክለዋል።ከዚያም ዶቃዎቹ በ1x RIP ቋት አራት ጊዜ ታጥበው በ1x SDS ቋት ተለቀቁ።የተገኘው PACT እና PKR በWB ተገኝተዋል።