ዜና

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ አለው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።እስከዚያው ድረስ ቀጣይ ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
በነቃ esters ወይም phenoxy radicals ላይ የተመሰረቱ የኢንዛይማቲክ ቅርበት መለያ ዘዴዎች በህያዋን ህዋሶች ውስጥ ንዑስ ሴሉላር ፕሮቲዮሞችን እና የፕሮቲን መስተጋብሮችን ለመቅረጽ በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ።ነገር ግን፣ የነቁ esters ብዙም ምላሽ የሰጡ አይደሉም፣ ይህም ሰፊ የመለያ ራዲየስ ያስገኛል፣ እና በፔሮክሳይድ ህክምና የሚመነጩ የ phenoxy radicals redox paths ላይ ጣልቃ ሊገቡ ይችላሉ።እዚህ ላይ የሚኒሶግ ፎቶሴንቲዘር ፕሮቲንን ከፍላጎት ፕሮቲን ጋር በዘረመል በማገናኘት የተሰራውን የቀረቤታ መለያ ጥገኛ ፎቶአክቲቬሽን (PDPL) ዘዴን ሪፖርት እናደርጋለን።በሰማያዊ ብርሃን በመነሳሳት እና በተጋላጭነት ጊዜ ቁጥጥር የሚደረግለት ነጠላ ኦክስጅን ይፈጠራል ከዚያም በጊዜያዊነት የሂስቲዲን ቅሪቶችን በአኒሊን መፈተሻ መለያ ምልክት ማድረግ ይከናወናል።ከፍተኛ ታማኝነቱን በኦርጋኔል-ተኮር ፕሮቲን ካርታ እናሳያለን።የPDPL ከጎን ከ TurboID ጋር ማነፃፀር የበለጠ የተለየ እና አጠቃላይ የPDPL ፕሮቲዮሚክ ሽፋን ያሳያል።በመቀጠል ፒዲኤልኤልን ከበሽታ ጋር ለተያያዘው ግልባጭ ኮአክቲቪተር BRD4 እና E3 Parkin ligase አመለከትን እና ከዚህ ቀደም የማይታወቁ መስተጋብሮችን አግኝተናል።ከመጠን በላይ ኤክስፕሬሽን በማጣራት ፣ ሁለት የማይታወቁ ንዑሳን ክፍሎች ፣ Ssu72 እና SNW1 ፣ ለፓርኪን ተለይተዋል ፣ የእሱ መበላሸት በየቦታው-ፕሮቲንሶም መንገድ መካከለኛ ነው።
የፕሮቲን ኔትወርኮች ትክክለኛ ባህሪ ብዙ መሠረታዊ ሴሉላር ሂደቶችን ያቀፈ ነው።ስለዚህ የፕሮቲን መስተጋብር እጅግ በጣም ትክክለኛ የሆነ የቦታ ካርታ ስራ ባዮሎጂካል መንገዶችን፣ የበሽታ ፓቶሎጂን ለመለየት እና እነዚህን ግንኙነቶች ለህክምና ዓላማዎች ለማወክ ሞለኪውላዊ መሰረት ይሆናል።ለዚህም, በህያዋን ህዋሳት ወይም ቲሹዎች ውስጥ ጊዜያዊ ግንኙነቶችን ለመለየት የሚያስችሉ ዘዴዎች በጣም ተፈላጊ ናቸው.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) በታሪክ የፍላጎት ፕሮቲኖች (POI) ትስስር አጋሮችን ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል።በቁጥር ፕሮቲዮሚክስ ዘዴዎች እድገት ፣ Bioplex3.0 ተፈጠረ ፣ ትልቁ የፕሮቲን አውታረ መረቦች በ AP-MS ላይ የተመሠረተ።ምንም እንኳን AP-MS በጣም ኃይለኛ ቢሆንም፣ በስራ ሂደት ውስጥ ያለው የሴል ሊሲስ እና የማሟሟት እርምጃዎች ደካማ እና ጊዜያዊ አስገዳጅ መስተጋብር ላይ ያተኮሩ እና ከሊሲስ በፊት ክፍልፋይ የሌላቸውን እንደ አስመሳይ መስተጋብር ጥንዶች ያሉ የድህረ-ሊሲስ ቅርሶችን ያስተዋውቃሉ።
እነዚህን ችግሮች ለመፍታት ከተፈጥሮ ውጪ የሆኑ አሚኖ አሲዶች (UAA) ከቡድን ተሻጋሪ ቡድኖች እና ኢንዛይማቲክ በአቅራቢያው መሰየሚያ (PL) መድረኮች (ለምሳሌ APEX እና BioID) 5 ተዘጋጅተዋል።ምንም እንኳን የ UAA ዘዴ በብዙ ሁኔታዎች በተሳካ ሁኔታ የተተገበረ እና ቀጥተኛ የፕሮቲን ማጣበቂያዎችን በተመለከተ መረጃ ቢሰጥም፣ የ UAA ማስገቢያ ቦታን ማመቻቸት አሁንም ያስፈልጋል።ከሁሉም በላይ፣ የመለያ ክስተቶችን መቀልበስ የማያስፈልገው የስቶይቺዮሜትሪክ መለያ ዘዴ ነው።በአንፃሩ እንደ ባዮአይዲ ዘዴ ያሉ ኢንዛይማቲክ PL ዘዴዎች ኢንጂነሪንግ ባዮቲን ሊጋሴን ከ POI7 ጋር በማዋሃድ ባዮቲንን በማንቃት ምላሽ ሰጪ ባዮቲኒል-ኤኤምፒ ኢስተር መካከለኛ ይፈጥራል።በዚህ ምክንያት ኢንዛይሙ የነቃ የላይሲን ቅሪቶችን የሚለይ የነቃ ባዮቲን “ደመና” ይለቃል።ነገር ግን ባዮአይዲ በቂ ምልክት የተደረገበት ምልክት ለማግኘት ከ12 ሰአታት በላይ ይፈልጋል፣ ይህም በጊዜያዊ ጥራት መጠቀምን ይከለክላል።በእርሾ ማሳያ ላይ የተመሰረተ የዝግመተ ለውጥን በመጠቀም፣ ቱርቦ መታወቂያ በባዮአይዲ ላይ ተመስርቶ የበለጠ ቀልጣፋ እንዲሆን ተዘጋጅቷል፣ በ10 ደቂቃ ውስጥ ባዮቲንን ቀልጣፋ መለያ መስጠት በመፍቀድ የበለጠ ተለዋዋጭ ሂደቶችን ለማጥናት ያስችላል።ቱርቦ መታወቂያ በጣም ንቁ ስለሆነ እና ለዝቅተኛ ደረጃ መለያዎች ኢንዶጂን ያለው የባዮቲን መጠን በቂ ስለሆነ፣ የበስተጀርባ መለያ መለጠፍ በጣም የተሻሻለ እና በጊዜ የተያዘ መለያ ከውጪ ባዮቲን መጨመር ሲያስፈልግ ችግር ሊሆን ይችላል።በተጨማሪም የነቃ esters ደካማ ምላሽ (t1/2 ~ 5 ደቂቃ) ናቸው, ይህም ትልቅ መለያ ራዲየስ ሊያስከትል ይችላል, በተለይ ባዮቲን 5 ጋር ጎረቤት ፕሮቲኖች ሙሌት በኋላ. በሌላ አቀራረብ, ምሕንድስና ascorbate peroxidase (ማለትም ባዮቲን-) ጄኔቲክ ውህድ. phenol radicals እና ፕሮቲን መለያ በአንድ ደቂቃ ውስጥ ይፈቅዳል9,10. APEX በሰፊው subcellular proteomes, membrane ፕሮቲን ውስብስብ, እና ሳይቶሶሊክ ምልክት ፕሮቲን ውስብስብ ለመለየት ጥቅም ላይ ይውላል. ነገር ግን, የፔሮክሳይድ ከፍተኛ ትኩረት አስፈላጊነት redox ፕሮቲኖች ወይም መንገዶች ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል. ሴሉላር ሂደቶች.
ስለዚህ የተንቀሳቃሽ ስልክ መንገዶችን በከፍተኛ ሁኔታ ሳያስተጓጉሉ የበለጠ ምላሽ ሰጪ ምልክት የተደረገባቸው ራዲየስ ማፈን ዝርያዎችን ማፍራት የሚችል አዲስ ዘዴ ለነባር ዘዴዎች ጠቃሚ ይሆናል ። ከተለዋዋጭ ዝርያዎች መካከል፣ ነጠላ ኦክሲጅን ትኩረታችንን የቀሰቀሰው አጭር የህይወት ዘመኑ እና ውሱን የስርጭት ራዲየስ (t1/2 <0.6 µs በሴሎች)13. ከተለዋዋጭ ዝርያዎች መካከል፣ ነጠላ ኦክሲጅን ትኩረታችንን የቀሰቀሰው አጭር የህይወት ዘመኑ እና ውሱን የስርጭት ራዲየስ (t1/2 <0.6 µs በሴሎች)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. ከንቁ ቅርጾች መካከል ነጠላ ኦክሲጅን ትኩረታችንን የሳበው በአጭር የህይወት ዘመኑ እና በተወሰነ የስርጭት ራዲየስ (t1/2 <0.6 µs በሴሎች)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs） 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). ንቁ ከሆኑ ቅርጾች መካከል ነጠላ ኦክሲጅን ትኩረታችንን ይስባል ምክንያቱም አጭር የህይወት ዘመኑ እና ውስን ስርጭት ራዲየስ (t1/2 <0.6 μs በሴሎች)።ነጠላ ኦክሲጅን ሜቲዮኒን፣ ታይሮሲን፣ ሂስቲዲን እና ትራይፕቶፋን በዘፈቀደ ኦክሲጅን እንደሚያደርግ ተዘግቧል፣ ይህም ፖላር 14,15 ከአሚን ወይም ከቲዮል መሰረት ያለው ፕሮብስ16፣17 ጋር እንዲያያዝ ያደርገዋል።ምንም እንኳን ነጠላ ኦክሲጅን ንዑስ ሴሉላር ክፍልን አር ኤን ኤ ለመሰየም ጥቅም ላይ የዋለ ቢሆንም፣ ውስጣዊ የ POI ቅርበት ምልክቶችን እንደገና ለመጠቀም ስልቶች አልተመረመሩም።እዚህ፣ የፎቶአክቲቬሽን-ጥገኛ ፕሮክሲምቲ መለያ (PDPL) የሚባል መድረክ አቅርበናል፣ ከሚኒሶግ ፎቶሴንቲዘር ጋር የተዋሃደውን ፒኦአይአይኤስ ለማብራት እና ነጠላ ኦክሲጅን ትውልድን በማስነሳት ተቀራራቢ ቅሪቶችን ኦክሳይድ ለማድረግ ሰማያዊ መብራትን እንጠቀማለን፣ በመቀጠልም አሚን የያዙ ማሻሻያዎችን በማድረግ ኬሚካላዊ መመርመሪያዎችን ኦክሳይድ ለማድረግ መካከለኛ ህይወት ያላቸው ሴሎች..የመለያ ስፔሲፊኬሽንን ከፍ ለማድረግ እና ክፍት ፕሮቲዮሚክስ የስራ ፍሰትን በመጠቀም የማሻሻያ ጣቢያዎችን ለይተናል።የPDPL ከጎን ከ TurboID ጋር ማነፃፀር የበለጠ የተለየ እና አጠቃላይ የPDPL ፕሮቲዮሚክ ሽፋን ያሳያል።ይህንን አቀራረብ ለኦርጋኔል-ተኮር ጠቋሚዎች ንዑስ ሴሉላር ፕሮቲዮም እና አጠቃላይ ፕሮቲዮም ማያያዣ አጋሮችን ከካንሰር ጋር ለተያያዘ ኤፒጄኔቲክ ተቆጣጣሪ ፕሮቲን BRD4 እና ከፓርኪንሰን በሽታ ጋር ለተያያዘው E3 ሊጋዝ ፓርኪን ተጠቀምነው። መስተጋብር..በትልልቅ የፕሮቲን ውህዶች ውስጥ የፒዲኤልኤልን የ E3 ንኡስ ንጣፎችን የመለየት ችሎታ ቀጥተኛ ያልሆነ ማያያዣዎችን ማወቅ የሚያስፈልግበትን ሁኔታ ይወክላል።ሁለት የማይታወቁ የፓርኪን ንጥረነገሮች በየቦታው ተረጋግጠዋል-ፕሮቲሶም መካከለኛ።
የፎቶዳይናሚክ ቴራፒ (ፒዲቲ)19 እና በክሮሞፎሬ የታገዘ ሌዘር ኢንአክቲቬሽን (CALI)20፣ በፎቶሰንሲታይዘር አማካኝነት የብርሃን ጨረር ነጠላ ኦክሲጅን ያመነጫል፣ የታለሙ ፕሮቲኖችን ማንቀሳቀስ ወይም የሕዋስ ሞት ሊያስከትል ይችላል።ነጠላ ኦክሲጅን ወደ 70 nm አካባቢ ያለው የንድፈ ሃሳብ ስርጭት ርቀት ያለው በጣም ምላሽ ሰጪ ንጥረ ነገር ስለሆነ በፎቶሴንቲዘር ዙሪያ የቦታ ውስን ኦክሳይድ መቆጣጠር ይቻላል።በዚህ ፅንሰ-ሀሳብ ላይ በመመስረት በህያዋን ህዋሶች ውስጥ የፕሮቲን ውስብስቦችን በቅርበት ለመሰየም ነጠላ ኦክሲጅን ለመጠቀም ወስነናል።አራት ተግባራትን ለማሟላት የፒዲኤልኤል ኬሞፕሮቴኦሚክ አቀራረብ አዘጋጅተናል፡ (1) ከ PL ኢንዛይማዊ አቀራረብ ጋር ተመሳሳይ የሆነ ንቁ ነጠላ ኦክሲጅን ማመንጨት;(2) በብርሃን ጅምር ላይ በጊዜ-የተፈታ መለያ መስጠት;(3) በለውጥ (4) የጀርባ አመጣጥን ለመቀነስ ውስጣዊ ውስጣዊ አካላትን (እንደ ባዮቲን ያሉ) ከመጠቀም ይቆጠቡ ወይም ለአካባቢ ጭንቀት የሕዋስ መጋለጥን ለመቀነስ በጣም የሚረብሹ ውጫዊ ሬጀንቶችን (እንደ ፐሮክሳይድ ያሉ) ይጠቀሙ።
Photosensitizers አነስተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት fluorophores (ለምሳሌ ሮዝ ቤንጋል, methylene ሰማያዊ) 22 እና ዘረመል አነስተኛ ፕሮቲኖች (ለምሳሌ miniSOG, KillerRed) 23 ጨምሮ በሁለት ምድቦች ሊከፈል ይችላል.ሞዱላር ዲዛይን ለማግኘት፣ የፎቶሴንቲዘር (PS) ፕሮቲኖችን ወደ POI24,25 (ምስል 1 ሀ) በመጨመር የመጀመሪያውን ትውልድ የፒ.ዲ.ኤል.ኤልን መድረክ አዘጋጅተናል።በሰማያዊ ብርሃን ሲፈነዳ ነጠላ ኦክሲጅን የኑክሊዮፊል አሚኖ አሲድ ቀሪዎችን ኦክሳይድ ያደርጋል፣ በዚህም ምክንያት ኤሌክትሮፊሊካል የሆነ እና በአሚን መፈተሻ ኑክሊዮፊል 16፣17 ምላሽ ሊሰጥ ይችላል።ፍተሻው በኬሚስትሪ ጠቅ ለማድረግ እና ለኤልሲ/ኤምኤስ/ኤምኤስ ባህሪ ወደ ታች ለመጎተት በአልካይን እጀታ ተዘጋጅቷል።
በ miniSOG አማላጅነት የፕሮቲን ውስብስቦች መለያ መሰየሚያ ንድፍ ሥዕላዊ መግለጫ።ለሰማያዊ ብርሃን ሲጋለጡ፣ ሚኒሶግ-POIን የሚገልጹ ሴሎች ነጠላ ኦክሲጅን ያመነጫሉ፣ ይህም መስተጋብር የሚፈጥሩ ፕሮቲኖችን የሚቀይር ነገር ግን ተያያዥ ያልሆኑ ፕሮቲኖችን ነው።የፎቶ ኦክሳይድ መሃከለኛ ምርቶች በአሚን ኬሚካላዊ መመርመሪያ ቅብብል መለያዎች ተጠልፈው ኮቫለንት አዱክትስ ይፈጥራሉ።በኬሚስትሪ ፍተሻ ላይ ያለው የአልኪኒል ቡድን ጠቅታ ኬሚስትሪን ለማበልጸግ ይፈቅዳል ወደ ታች በመውረድ ከዚያም LC-MS/MS quntitation።b የአሚን መመርመሪያዎች ኬሚካላዊ መዋቅር 1-4.ሐ ወካይ የፍሎረሰንት ጄል ትንታኔ ሚቶኮንድሪያል አካባቢያዊ ሚኒሶግ-መካከለኛ ፕሮቲዮሚክ ማርከሮችን በመጠቀም መመርመሪያዎች 1-4 እና በጄል ዴንሲቶሜትሪ ላይ የተመሰረተ አንጻራዊ መጠን።የኬሚካል መመርመሪያዎች ከሲግናል ወደ ዳራ ጥምርታ ሰማያዊ ብርሃንን ሳይጨምር አሉታዊ የቁጥጥር ሙከራዎችን በመጠቀም ወይም HEK293T ሴሎችን ያለ miniSOG አገላለጽ ተገምግሟል።n = 2 ባዮሎጂያዊ ገለልተኛ ናሙናዎች.እያንዳንዱ ነጥብ ባዮሎጂያዊ ቅጂን ይወክላል።d የተመቻቸ መጠይቅን 3 በመጠቀም የPDPL ተወካይ እና መጠናቸው የተጠቆሙት የPDPL ክፍሎች ባሉበት ወይም በሌሉበት እንደ ሐ.n = 3 ባዮሎጂያዊ ገለልተኛ ናሙናዎች.እያንዳንዱ ነጥብ ባዮሎጂያዊ ቅጂን ይወክላል።ማእከላዊ መስመሮች እና ጢስ ማውጫዎች አማካይ እና ± መደበኛ መዛባትን ያመለክታሉ።CBB: Coomassie ብሩህ ሰማያዊ.የሩቅ-ቀይ የሲ-ዲኤምኤ እድፍ ያለው ነጠላ ኦክሲጅን ኮንፎካል ምስል።የመጠን አሞሌ፡ 10µmጄል ኢሜጂንግ እና ኮንፊካል ሙከራዎች በተናጥል ቢያንስ ሁለት ጊዜ በተመሳሳይ ውጤት ተደግመዋል።
በመጀመሪያ ደረጃ በ HEK293T ውስጥ የተገለጹትን የጎለመሱ ፎቶሴንሴስቲዘርሮች miniSOG26 እና KillerRed23 ችሎታን ሞከርን የፕሮፓጋላሚን ፕሮቲኖምን እንደ ኬሚካላዊ መፈተሻ መሰየምን (ተጨማሪ ምስል 1 ሀ)።የጄል ፍሎረሰንስ ትንታኔ እንደሚያሳየው ሙሉ ፕሮቲዮም መለያ ሚኒሶግ እና ሰማያዊ ብርሃን ጨረር በመጠቀም የተገኘ ሲሆን በኪለር ሬድ ምንም የሚታይ የመለያ ምርት አልታየም።የምልክት ወደ ዳራ ጥምርታ ለማሻሻል አኒሊን (1 እና 3)፣ ፕሮፒላሚን (2) ወይም ቤንዚላሚን (4) የያዙ የኬሚካል መመርመሪያዎችን ሞከርን።HEK293T ሴሎች እራሳቸው ምንም ሰማያዊ ብርሃን ከሌላቸው ጋር ሲነፃፀሩ ከፍ ያለ የበስተጀርባ ምልክት እንዳላቸው ተመልክተናል። አኒሊን ላይ የተመረኮዙ ኬሚካላዊ መመርመሪያዎች 1 እና 3 የተሻለ ልዩነትን ሰጡ፣ HEK293T በሚቶኮንድሪያ ውስጥ ሚኒሶግ በተረጋጋ ሁኔታ ሲገልጽ> 8 እጥፍ ለምርመራ 3 ሲግናል ያሳየ ሲሆን መፈተሻ 2 ደግሞ በአር ኤን ኤ መሰየሚያ ዘዴ CAP-seq ~2.5- ብቻ ያሳያል የማጠፍ ምልክት መጨመር፣ በአር ኤን ኤ እና ፕሮቲን መካከል ባሉ የተለያዩ የእንቅስቃሴ ምርጫዎች ምክንያት ሊሆን ይችላል (ምስል 1 ለ፣ ሐ)። አኒሊን ላይ የተመረኮዙ ኬሚካላዊ መመርመሪያዎች 1 እና 3 የተሻለ ልዩነትን ሰጡ፣ HEK293T በሚቶኮንድሪያ ውስጥ ሚኒሶግ በተረጋጋ ሁኔታ ሲገልጽ> 8 እጥፍ ለምርመራ 3 ሲግናል ያሳየ ሲሆን መፈተሻ 2 ደግሞ በአር ኤን ኤ መሰየሚያ ዘዴ CAP-seq ~2.5- ብቻ ያሳያል የማጠፍ ምልክት መጨመር፣ በአር ኤን ኤ እና ፕሮቲን መካከል ባሉ የተለያዩ የእንቅስቃሴ ምርጫዎች ምክንያት ሊሆን ይችላል (ምስል 1 ለ፣ ሐ)።በአኒሊን ላይ የተመረኮዙ ኬሚካላዊ መመርመሪያዎች 1 እና 3 የተሻለ ልዩነት አሳይተዋል፡ HEK293T፣ ሚቶኮንድሪያ ውስጥ ሚኒሶግን በተረጋጋ ሁኔታ የሚገልጽ፣ ለምርመራ 3 የምልክት መጠን ከ8 እጥፍ በላይ ሲጨምር ያሳያል። ያሳያል ~ 2.5- እጥፍ የሲግናል ጭማሪ፣ ምናልባትም በአር ኤን ኤ እና ፕሮቲን መካከል ባሉ የተለያዩ የእንቅስቃሴ ምርጫዎች (ምስል 1 ለ፣ ሐ)።基于 苯胺 的 化学 1 具有探针 具有 具有 更 更 特异性 的 的 粒体 粒体 粒体 粒体 表达 表达 表达 表达 表达 表达 增加 表达 倍 倍 倍 倍 倍 倍 倍 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 2 仅 2 仅 显示 显示2.5-信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）基于 苯胺 化学 化学 1 具有 具有 具有 具有 具有 的 的 具有 中 中 ሚኒ ሚኒንግ, 探针 3 的 信号 增加 稳定 表达 于 于 于 标记 标记 2 ~ ~ 2 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAበአኒሊን ላይ የተመሰረቱ ኬሚካላዊ መመርመሪያዎች 1 እና 3 የተሻለ ልዩነት ነበራቸው፣ HEK293T ሚኒሶግ በማይቶኮንድሪያ ውስጥ በተረጋጋ ሁኔታ ገልፀዋል፣ እና መጠይቅ 3 የምልክት መጠን ከ8 እጥፍ በላይ ጨምሯል፣ የ CAP-seq አር ኤን ኤ መለያ ዘዴ ደግሞ የ2.5 እጥፍ ጭማሪ አሳይቷል።በሲግናል ውስጥ, ምናልባት በአር ኤን ኤ እና በፕሮቲን መካከል ባለው የተለያየ ምላሽ ምርጫዎች (ምስል 1 ለ, ሐ).በተጨማሪም የዳሰሳ ጥናት 3 isomers እና hydrazine probes (መመርመሪያዎች 5, 6, 7) ተፈትነዋል, ይህም የ 3 (ተጨማሪ ምስል 1 ለ, ሐ) ማመቻቸትን ያረጋግጣል.በተመሳሳይ የ in-gel fluorescence ትንተና ሌሎች የተመቻቹ የሙከራ መለኪያዎችን አሳይቷል-የጨረር ሞገድ ርዝመት (460 nm) ፣ የኬሚካል መፈተሻ ትኩረት (1 ሚሜ) እና የጨረር ጊዜ (20 ደቂቃ) (ተጨማሪ ምስል 2a-c)።በPDPL ፕሮቶኮል ውስጥ የትኛውንም አካል ወይም እርምጃ መተው ጉልህ የሆነ ምልክት ወደ ከበስተጀርባ መቀልበስ አስከትሏል (ምስል 1d)።በተለይ ሶዲየም አዚድ ወይም ትሮሎክስ ባለበት ሁኔታ የፕሮቲን መለያው በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል ፣ እነዚህም ነጠላ ኦክስጅንን ያጠፋሉ ።ነጠላ ኦክስጅንን ለማረጋጋት የሚታወቀው D2O መኖሩ የመለያ ምልክትን ያሻሽላል.ሌሎች አጸፋዊ የኦክስጅን ዝርያዎችን ለመሰየም ያበረከቱትን አስተዋፅኦ ለመመርመር ማንኒቶል እና ቫይታሚን ሲ ሃይድሮክሳይል እና ሱፐርኦክሳይድ ራዲካል ስካቬንተሮችን በቅደም ተከተል 18, 29 ለማቋቋም ተጨምረዋል, ነገር ግን መለያዎችን የሚቀንሱ አልተገኘም.የ H2O2 መጨመር, ግን ማብራት አይደለም, መለያ መስጠትን አላመጣም (ተጨማሪ ምስል 3 ሀ).Fluorescence singlet oxygen imaging ከሲ-ዲኤምኤ መመርመሪያዎች ጋር ነጠላ ኦክሲጅን በHEK293T-miniSOG ሽቦ ውስጥ መኖሩን አረጋግጧል ነገር ግን በመጀመሪያው HEK293T ሽቦ ውስጥ የለም።በተጨማሪም mitoSOX Red ከብርሃን በኋላ የሱፐርኦክሳይድ ምርትን መለየት አልቻለም (ምስል 1e እና ተጨማሪ ምስል 3 ለ) 30. እነዚህ መረጃዎች ነጠላ ኦክስጅን ለቀጣይ ፕሮቲዮሚክ መለያ ምልክት ዋና ምላሽ ሰጪ የኦክስጂን ዝርያዎች መሆናቸውን በጥብቅ ይጠቁማሉ።የፒ.ዲ.ኤል.ኤል ሳይቶቶክሲካዊነት ሰማያዊ ብርሃን ጨረር እና ኬሚካላዊ መመርመሪያዎችን ጨምሮ ተገምግሟል፣ እና ምንም ጉልህ የሆነ ሳይቶቶክሲካዊነት አልታየም (ተጨማሪ ምስል 4 ሀ)።
የመለኪያ ዘዴን ለማጥናት እና LC-MS/MSን በመጠቀም የፕሮቲን ውህዶችን ፕሮቲን ለይቶ ለማወቅ በመጀመሪያ የትኞቹ አሚኖ አሲዶች እንደተሻሻሉ እና የዴልታ ብዛት የመመርመሪያ መለያዎችን መወሰን አለብን።ሜቲዮኒን፣ ሂስቲዲን፣ ትራይፕቶፋን እና ታይሮሲን በነጠላ ኦክስጅን እንደተሻሻሉ ተዘግቧል14፣15።የ TOP-ABPP31 የስራ ፍሰት በMSFragger32 ላይ በተመሠረተው በ FragPipe ኮምፒውቲንግ መድረክ ከሚቀርበው አድሎአዊ ያልሆነ ክፍት ፍለጋ ጋር እናዋህዳለን።ነጠላ ኦክሲጅን ማሻሻያ እና የኬሚካል መመርመሪያ መለያ ምልክት ከተደረገበት በኋላ የክሊክ ኬሚስትሪ የሚከናወነው ሊሰነጣጠቅ የሚችል ማገናኛን በያዘ የባዮቲን ቅነሳ መለያ በመጠቀም ከዚያም የኒውትራቪዲን ዝርጋታ እና ትራይፕሲን መፈጨትን ያካትታል።የተሻሻለው ፔፕታይድ፣ አሁንም ከረጢቱ ጋር የተሳሰረ፣ ለኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ትንተና (ምስል 2a እና ተጨማሪ መረጃ 1) በፎቶ ክሊክ ተደርጓል።ከ50 በላይ የፔፕታይድ ካርታ (PSM) ግጥሚያዎች ተዘርዝረው በፕሮቲሞም ውስጥ ከፍተኛ ቁጥር ያላቸው ማሻሻያዎች ተከስተዋል (ምስል 2 ለ)።የሚገርመው፣ የሂስታዲን ለውጥ ብቻ ነው የተመለከትነው፣ ምናልባትም ከሌሎች አሚኖ አሲዶች የበለጠ ኦክሳይድ የተደረገ ሂስቲዲን ወደ አኒሊን መመርመሪያዎች ከፍተኛ ምላሽ በመስጠት ነው።በታተመው የሂስታዲን ኦክሲዴሽን በነጠላ ኦክሲጅን፣21,33 የታቀደው የዴልታ-ጅምላ መዋቅር +229 ዳ ከሁለት ኦክሳይድ በኋላ ከ2-oxo-histidine ጋር መፈተሻ 3 ከቀረበው ጋር ይዛመዳል፣+247 ዳ ደግሞ የሃይድሮሊሲስ ምርት ነው። የ +229 ዳ (ተጨማሪ ምስል 5).የ MS2 ስፔክትረም ግምገማ የተሻሻሉ ቁርጥራጮችን (y እና b) መለየትን ጨምሮ አብዛኛዎቹን y እና b ions የመለየት ከፍተኛ አስተማማኝነት አሳይቷል (ምስል 2 ሐ)።በPDPL የተሻሻሉ ሂስቲዳይኖች የአካባቢ ቅደም ተከተል አውድ ትንተና ለትንንሽ የሃይድሮፎቢክ ቅሪቶች በ± 1 አቀማመጥ (ተጨማሪ ምስል 4 ለ) መጠነኛ ሞቲፍ ምርጫን አሳይቷል።በአማካይ በአንድ ፕሮቲን 1.4 ሂስቲዳይኖች ተለይተዋል፣ እና የእነዚህ ጠቋሚዎች ቦታ የሚወሰነው በሟሟ ተደራሽ ወለል አካባቢ (SASA) እና አንጻራዊ የሟሟ ተገኝነት (RSA) ትንተና (ተጨማሪ ምስል 4c፣d) ነው።
በMSFragger የተጎላበተውን የ FragPipe ማስላት መድረክን በመጠቀም ቀሪ መራጭነትን ለማጥናት የማያዳላ የስራ ሂደት።ከስትሬፕታቪዲን ሬንጅ የተሻሻሉ peptides photocleavage ለመፍቀድ በክሊክ ኬሚስትሪ ውስጥ ሊሰሉ የሚችሉ ማገናኛዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ።በርካታ ማሻሻያዎችን እና ተዛማጅ ቅሪቶችን ለመለየት ክፍት ፍለጋ ተጀመረ።b በመላው ፕሮቲዮም ውስጥ የሚከሰቱ ለውጦችን በብዛት ይመድቡ።የፔፕታይድ ካርታ ስራ PSM.c MS2 የሂስታዲን ሳይቶች በምርመራ የተሻሻለው ስፔክትራል ማብራሪያ 3. እንደ ተወካይ ምሳሌ፣ ከምርመራ 3 ጋር የተደረገ የኮቫለንት ምላሽ በተሻሻለው አሚኖ አሲድ ላይ +229.0938 ዳ ታክሏል።d የሚውቴሽን ሙከራ ለ PDPL ማርከሮች ለመፈተሽ ያገለግል ነበር።PRDX3 (H155A, H225A) እና PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ለፀረ-ባንዲራ ማወቂያ በዱር-አይነት ፕላዝማይድ ተለወጡ።ሠ ሰው ሠራሽ peptide በተጣራ ሚኒሶግ በ probe 3 ፊት ምላሽ ተሰጥቶታል እና Δm +247 እና +229 ያላቸው ተዛማጅ ምርቶች በኤልሲ-ኤምኤስ ስፔክትረም ውስጥ ተጠቅሰዋል።ከ miniSOG-6xHis-tag እና ፀረ-6xየሂስ ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ተመስሎ በብልቃጥ ውስጥ ከፕሮቲን ወደ ፕሮቲን መስተጋብር።አንቲባዮቲን (ስትሬፕታቪዲን-ኤችአርፒ) እና ፀረ-አይጥ ምዕራባዊ ብሎት ትንተና የሚኒሶግ-6xHis/anti-6xየእሱ ፀረ እንግዳ አካላት ውስብስቦች በምርምር 3 ምልክት የተደረገባቸው ለብርሃን መጋለጥ ጊዜ ላይ በመመስረት።የነጠላ ፕሮቲኖች መለያዎች በተዛማጅ ሞለኪውላዊ ክብደት ውስጥ ተገልጸዋል፡ LC antibody light chain፣ HC antibody ከባድ ሰንሰለት።እነዚህ ሙከራዎች በተናጥል ቢያንስ ሁለት ጊዜ በተመሳሳይ ውጤት ተደግመዋል።
የመለያ ቦታውን ባዮኬሚካል ለማረጋገጥ፣ በጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ተለይተው የሚታወቁት PRDX3 እና PRDX1 ከሂስቲዳይን ወደ አላኒን ተለውጠዋል እና ከዱር ዝርያ ጋር በማነፃፀር የመተላለፊያ ሙከራዎች ተነጻጽረዋል።የPDPL ውጤቶች እንደሚያሳዩት ሚውቴሽን መለያ መስጠትን በእጅጉ ቀንሷል (ምስል 2d)።ይህ በእንዲህ እንዳለ በክፍት ፍለጋ ውስጥ ተለይተው የታወቁት የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች የተዋሃዱ እና በቪትሮ ከተጣራ ሚኒሶግ ጋር በቪትሮ 3 እና በሰማያዊ ብርሃን ፊት ምላሽ ተሰጥተዋል ፣ ይህም በ LC-MS ሲታወቅ በ +247 እና +229 Da የጅምላ ፈረቃ ምርቶችን ይሰጣል (ምስል) .2 ሠ)።).ለሚኒሶግ ፎቶ አግብር ምላሽ በብልቃጥ ውስጥ የሚገናኙ ፕሮክሲማል ፕሮቲኖች መሰየም ይችሉ እንደሆነ ለመፈተሽ በሚኒሶግ-6xHis ፕሮቲን እና በብልቃጥ ውስጥ ባለው ጸረ-እሱ ሞኖክሎናል አንቲቦዲ (ምስል 2f) መካከል ባለው መስተጋብር ሰው ሰራሽ የቀረቤታ ጥናት አዘጋጅተናል።በዚህ ዳሰሳ፣ ፀረ-ሰው ከባድ እና ቀላል ሰንሰለቶች በሚኒሶግ መጠጋጋት ጠብቀን ነበር።እንዲያውም ፀረ-መዳፊት (የፀረ-6xHis-የተሰየመ ፀረ እንግዳ አካልን ከባድ እና ቀላል ሰንሰለቶችን በመገንዘብ) እና ስቴፕታቪዲን ምዕራባዊ ብሎቶች የከባድ እና ቀላል ሰንሰለቶችን ጠንካራ ባዮቲኒሊሽን አሳይተዋል።በተለይም በ 6xHis መለያ እና በቀላል እና በከባድ ሰንሰለቶች መካከል ያለው ማቋረጫ ምክንያት miniSOG autobiotinylation አስተውለናል።በማጠቃለያው፣ ፒ.ዲ.ኤል.ኤል ሂስታዲንን በቅርበት ጥገኛ በሆነ መልኩ እንደሚያስተካክለው ደርሰናል።
የሚቀጥለው ግባችን የቦታ መለያ መለያውን ልዩነት ለመፈተሽ የንዑስ ሴሉላር ፕሮቲዮምን መለየት ነበር።ስለዚህ፣ miniSOGን በኒውክሊየስ፣ ማይቶኮንድሪያል ማትሪክስ ወይም ውጫዊ የHEK293T ሴሎች ሽፋን (ምስል 3 ሀ) ውስጥ ገለጽን።የጄል ፍሎረሰንስ ትንተና በሦስት ንዑስ ሴሉላር ቦታዎች ላይ የተትረፈረፈ ምልክት የተደረገባቸው ባንዶች እና እንዲሁም የተለያዩ የመለያ ቅጦችን አሳይቷል (ምስል 3 ለ)።የፍሎረሰንት ኢሜጂንግ ትንተና የ PDPL ከፍተኛ ልዩነት አሳይቷል (ምስል 3 ሐ).የፒዲኤልኤል የስራ ፍሰት ተከትሏል የጠቅታ ምላሾች ከሮዳሚን ማቅለሚያዎች ጋር የንዑስ ሴሉላር ፕሮቲዮሞችን በፍሎረሰንት ማይክሮስኮፒ በመጠቀም ለመለየት እና የPDPL ምልክቶች ከ DAPI፣ mitochondrial trackers ወይም ER መከታተያዎች ጋር ተቀላቅለው የ PDPLን ከፍተኛ ታማኝነት አረጋግጠዋል።ለሶስቱ የአካል ክፍሎች፣ አቪዲን ዌስተርን ቦት በመጠቀም የPDPLን ከቱርቦአይዲ ጋር ጎን ለጎን ማነፃፀር ፒዲኤልኤል ከየራሳቸው ቁጥጥር ጋር ሲነፃፀሩ በተለየ ሁኔታ መሰየማቸውን አሳይቷል።በPDPL ሁኔታዎች፣ ብዙ የተሰየሙ ባንዶች ታዩ፣ ይህም ተጨማሪ በPDPL የተሰየሙ ፕሮቲኖችን ያመለክታሉ (ተጨማሪ ምስል 6a-d)።
የ miniSOG-መካከለኛ አካል-ተኮር ፕሮቲዮም መሰየሚያ ንድፍ ውክልና።ሚኒሶግ ወደ ሚቶኮንድሪያል ማትሪክስ በፊውዥን ወደ ኤን-ተርሚናል 23 አሚኖ አሲዶች የሰው COX4 (ሚቶ-ሚኒሶግ)፣ ኒውክሊየስ ወደ H2B (ኒውክሊየስ-ሚኒሶግ) እና ሴክ61β በ ER membrane (ER-miniSOG) ሳይቶፕላዝም ጎን በኩል ያነጣጠረ ነው። ).አመላካቾች ጄል ኢሜጂንግ፣ ኮንፎካል ኢሜጂንግ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ያካትታሉ።ለ የሶስት ኦርጋኔል-ተኮር ፒዲኤልኤል መገለጫዎች ተወካይ ጄል ምስሎች።CBB Coomassie ብሩህ ሰማያዊ።ሐ የHEK293T ሕዋሳት ሚኒሶግ በተረጋጋ ሁኔታ የሚኒሶግ የሚያሳዩ ምስሎች V5 (ቀይ) በተሰየመው ፀረ እንግዳ አካል ከተገኙ የተለያዩ ንዑስ ሴሉላር አከባቢዎች ጋር።ንዑስ ሴሉላር ማርከሮች ለ mitochondria እና ER (አረንጓዴ) ጥቅም ላይ ይውላሉ።የPDPL የስራ ፍሰት በCy3-azide ክሊክ ኬሚስትሪ በመጠቀም ሚኒሶግ (ቢጫ) ምልክት የተደረገባቸው ንዑስ ሴሉላር ፕሮቲዮሞችን ማወቅን ያካትታል።የመጠን አሞሌ፡ 10µmd የእሳተ ገሞራ ሴራዎች በPDPL መለያ የተደረገባቸው ፕሮቲዮሞች በተለያዩ የአካል ክፍሎች ውስጥ ባልተሰየመ የቁጥር መጠን (n = 3 ገለልተኛ ባዮሎጂካል ሙከራዎች)።ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ በእሳተ ገሞራ ቦታዎች ላይ ጥቅም ላይ ውሏል።HEK293T የዱር ዓይነት እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውሏል. በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ (p <0.05 እና> 2-fold ion intensity ልዩነት) ተለይተዋል. በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ (p <0.05 እና> 2-fold ion intensity ልዩነት) ተለይተዋል. Значительно በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ ጎልተው ይታያሉ (p <0.05 እና> በ ion ጥንካሬ ውስጥ 2 እጥፍ ልዩነት).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ ጎልተው ይታያሉ (p <0.05 እና > በ ion ጥንካሬ 2 እጥፍ ልዩነት)።ተዛማጅ ፕሮቲኖች ለHEK293T-miniSOG ጠቃሚ ነገር ግን ለHEK293T አስፈላጊ ያልሆኑ በአረንጓዴ ይታያሉ።ሠ የፕሮቲዮሚክ ዳታ ስብስቦችን ልዩነት ከሙከራዎች ትንተና መ.በእያንዳንዱ የአካል ክፍል (ቀይ እና አረንጓዴ ነጥቦች) ውስጥ ያሉት አጠቃላይ የስታቲስቲክስ ጉልህ ፕሮቲኖች ቁጥር ከላይ ምልክት ተደርጎበታል።ሂስቶግራም በ MitoCarta 3.0፣ GO ትንተና እና በA.Ting et al ላይ ተመስርተው በኦርጋኔል ውስጥ የተተረጎሙ ፕሮቲኖችን ያሳያሉ።ሰዎች.የሚቶኮንድሪያ፣ ኒውክሊየስ እና ኢአር የተለዩ የመረጃ ስብስቦች።እነዚህ ሙከራዎች በተናጥል ቢያንስ ሁለት ጊዜ በተመሳሳይ ውጤት ተደግመዋል።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።
በጄል እና ኢሜጂንግ ውጤቶች የተበረታታ፣ ከስያሜ ነፃ የሆነ መለኪያ በእያንዳንዱ የአካል ክፍል ውስጥ ያለውን የፕሮቲን መጠን ለመለካት ጥቅም ላይ ውሏል (ተጨማሪ መረጃ 2)።ያልተለወጠ HEK293T የበስተጀርባ ምልክቶችን ለመቀነስ እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውሏል። የእሳተ ገሞራ ሴራ ትንተና በከፍተኛ ደረጃ የበለፀጉ ፕሮቲኖችን (p <0.05 እና> 2-fold ion intensity) እንዲሁም ነጠላ ቶን ፕሮቲኖችን በ miniSOG ገላጭ መስመሮች (ምስል 3d ቀይ እና አረንጓዴ ነጥቦች) አሳይቷል። የእሳተ ገሞራ ሴራ ትንተና በከፍተኛ ደረጃ የበለፀጉ ፕሮቲኖችን (p <0.05 እና> 2-fold ion intensity) እንዲሁም ነጠላ ቶን ፕሮቲኖችን በ miniSOG ገላጭ መስመሮች (ምስል 3d ቀይ እና አረንጓዴ ነጥቦች) አሳይቷል። Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). የእሳተ ገሞራ ሴራ ትንተና በከፍተኛ ሁኔታ የበለጸጉ ፕሮቲኖችን (p<0.05 እና> 2-fold ion intensity) እንዲሁም ነጠላ ፕሮቲኖችን በ miniSOG ገላጭ መስመሮች (ምስል 3d, ቀይ እና አረንጓዴ ነጥቦች) ላይ ብቻ አሳይቷል.火山图 分析 显示 出 显着 显着 富集 蛋白质 (p <0.05 和 和 和 2 倍 倍 存 在于 在于 ሚኒሊሲንግ 表达 系 中 的 单一 蛋白质 (图 3 ዲ 红色 绿色点 绿色点).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 (P <0.05 和 和 2 倍 倍 在于 在于 在于 在于 ሚኒሊኮንግ 表达 表达 系 的 单一 (图 3 ዲ 红色 蛋白质 ...))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). የእሳተ ገሞራ ሴራ ትንተና በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀጉ ፕሮቲኖችን (p<0.05 እና > 2x ionic ጥንካሬ) እንዲሁም ነጠላ ፕሮቲኖች በ miniSOG አገላለጽ መስመር ላይ ብቻ ይገኛሉ (በምስል 3d ውስጥ ቀይ እና አረንጓዴ ነጥቦች)።እነዚህን መረጃዎች በማጣመር፣ በቅደም ተከተል 1364፣ 461 እና 911 በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆኑ የኒውክሌር፣ ሚቶኮንድሪያል እና ER የውጨኛው ሽፋን ፕሮቲኖችን ለይተናል።የኦርጋኔል-አካባቢያዊ ፒዲኤልኤልን ትክክለኛነት ለመተንተን MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) ትንታኔን እና A.Ting et al.የዳታ ስብስብ 8 ለ ሚቶኮንድሪያ ፣ ኒውክሊየስ እና ኢአር ጥቅም ላይ የዋለ ሲሆን የተገኙትን ፕሮቲኖች የኦርጋኔል ልዩነት ለመፈተሽ ከ 73.4 ፣ 78.5 እና 73.0% (ምስል 3e) ትክክለኛነት ጋር ይዛመዳል።የPDPL ልዩነት ፒዲኤልኤል ኦርጋኔል-ተኮር ፕሮቲዮሞችን ለመለየት ጥሩ መሣሪያ መሆኑን ያረጋግጣል።በተለይም፣ ተለይተው የታወቁ ሚቶኮንድሪያል ፕሮቲኖች (የማይቶኮንድሪያል ፕሮቲኖች) ትንተና እንደሚያሳየው፣ የተያዘው ፕሮቲን በዋናነት በማትሪክስ እና በውስጠኛው ሽፋን (226 እና 106 ፣ በቅደም ተከተል) ውስጥ ተሰራጭቷል፣ ይህም ከተለዩት ሚቶኮንድሪያል ፕሮቲኖች አጠቃላይ ቁጥር 91.7% (362) ነው።ከፍተኛ የ PDPL ደረጃም ተረጋግጧል (ተጨማሪ ምስል 7 ሀ)።በተመሳሳይም የንዑስ ኑክሌር ትንታኔ እንደሚያሳየው የተያዘው ፕሮቲን በዋናነት በኒውክሊየስ, ኑክሊዮፕላዝም እና ኒውክሊየስ (ተጨማሪ ምስል 7 ለ) ውስጥ ተከፋፍሏል.የኑክሌር ፕሮቲዮሚክ ትንታኔ ከኒውክሌር አከባቢ ምልክት peptide (3xNLS) ጋር ተመሳሳይ ትክክለኛነት ከ H2B ግንባታ ጋር ተመሳሳይነት አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 7c-h)።የPDPL ምልክት ማድረጊያን ልዩነት ለማወቅ፣ ኑክሌር ላሚኒን A ይበልጥ ግልጽ በሆነ አካባቢያዊ የPOI7 ወጥመድ ተመርጧል።ፒ.ዲ.ኤል.ኤል. 36 በከፍተኛ ደረጃ የበለጸጉ ፕሮቲኖችን ለይቷል፣ ከእነዚህም ውስጥ 12 ፕሮቲኖች (30.0% ላሚን ኤን ጨምሮ) በ String ዳታቤዝ የተብራሩ ላሚን ኤ መስተጋብር ያላቸው ፕሮቲኖች ከባዮአይዲ ዘዴ (122 ፕሮቲኖች) 28 ከ28 ከፍ ያለ ነው። %) 7. የእኛ ዘዴ ያነሱ ፕሮቲኖችን ለይቷል፣ ምናልባትም በተወሰኑ መለያ ቦታዎች ምክንያት፣ ይህም ይበልጥ ንቁ በሆነ ነጠላ ኦክሲጅን ሊገኝ ችሏል።የGO ትንታኔ እንደሚያሳየው የታወቁት ፕሮቲኖች በዋነኝነት የሚገኙት በኑክሊዮፕላዝም (26)፣ በኑክሌር ሽፋን (10)፣ በኑክሌር ሽፋን (9) እና በኑክሌር ቀዳዳዎች (5) ውስጥ ነው።በአጠቃላይ እነዚህ የኑክሌር-አከባቢ ፕሮቲኖች 80% የበለፀጉ ፕሮቲኖችን ይይዛሉ ፣ይህም የፒ.ዲ.ኤል.ኤልን ልዩነት ያሳያል (ተጨማሪ ምስል 8a-d)።
የፒዲኤልኤልን የአካል ክፍሎች የቅርበት ምልክት የማድረግ ችሎታ ካረጋገጥን በኋላ፣ ፒዲኤልኤል የPOI ትስስር አጋሮችን ለመተንተን ጥቅም ላይ መዋል ይችል እንደሆነ ሞከርን።በተለይም የሳይቶሶሊክ ፕሮቲኖችን የፒዲኤልኤል ትንታኔን ለመግለጽ ፈልገን ነበር፣ እነዚህም በከፍተኛ ተለዋዋጭ ባህሪያቸው ምክንያት ከሜምብራል-አካባቢያዊ አጋሮቻቸው የበለጠ አስቸጋሪ ኢላማዎች ተደርገው ይወሰዳሉ።የ Bromodomain እና extraterminal (BET) ፕሮቲን BRD4 በተለያዩ በሽታዎች ውስጥ ላለው ቁልፍ ሚና ትኩረታችንን ስቧል 35, 36 .በ BRD4 የተገነባው ውስብስብ የጽሑፍ አስተባባሪ እና አስፈላጊ የሕክምና ዒላማ ነው።የ c-myc እና Wnt5a ግልባጭ ሁኔታዎችን በመቆጣጠር BRD4 አጣዳፊ ማይሎይድ ሉኪሚያ (ኤኤምኤል)፣ በርካታ ማይሎማ፣ የቡርኪት ሊምፎማ፣ የአንጀት ካንሰር እና እብጠት በሽታዎች37,38 ቁልፍ ወሳኝ እንደሆነ ይታሰባል።በተጨማሪም፣ አንዳንድ ቫይረሶች እንደ ፓፒሎማቫይረስ፣ ኤች አይ ቪ እና SARS-CoV-236,39 ያሉ የቫይራል እና ሴሉላር ቅጂዎችን ለመቆጣጠር BRD4ን ያነጣጥራሉ።
ፒዲኤልኤልን በመጠቀም የBRD4 መስተጋብርን ካርታ ለመስራት ሚኒሶግ ከአጭር N- ወይም C-terminal isoform የBRD4 ጋር አጣምረናል።የፕሮቲን ውጤቶች በሁለቱ ግንባታዎች መካከል ከፍተኛ መደራረብን አሳይተዋል (ተጨማሪ ምስል 9 ሀ)።በ miniSOG-H2B ተለይቶ የሚታወቀው የኑክሌር ፕሮቲን 77.6% ፕሮቲኖችን ከBRD4 ጋር ይሸፍናል (ተጨማሪ ምስል 9 ለ)።ከዚያም የተለያዩ የመብራት ጊዜዎች (2, 5, 10, 20 min) የጠቋሚውን ራዲየስ ለማስተካከል ጥቅም ላይ ይውላሉ (ምስል 4a እና ተጨማሪ መረጃ 3).በአጭር የፎቶፔሪዮድስ ወቅት፣ ፒዲኤልኤል በዋነኛነት ቀጥተኛ ትስስር ያላቸውን አጋሮችን እንደሚሰፍር፣ ረዘም ያለ ጊዜ ደግሞ በአጭር የፎቶአክቲቬሽን ወቅቶች ተለይተው የሚታወቁ ፕሮቲኖችን እና በተዘዋዋሪ ውስብስቦች ላይ ኢላማዎችን እንደሚያጠቃልል ደርሰናል።እንደ እውነቱ ከሆነ, በአቅራቢያው ባሉ የጊዜ ነጥቦች (84.6% ለ 2 እና 5 ደቂቃዎች, 87.7% ለ 5 እና 10 ደቂቃዎች, 98.7% ለ 10 እና 20 ደቂቃዎች) (ምስል 4b እና ተጨማሪ ምስል 9c) መካከል ጠንካራ መደራረብ አግኝተናል.በሁሉም የሙከራ ቡድኖች ውስጥ፣ BRD4 ራስን መሰየሚያ ብቻ ሳይሆን እንደ MED1፣ CHD8፣ BICRA፣ NIPBL፣ SMC1A እና HMGB1 ያሉ በርካታ የታወቁ ኢላማዎችን በstring የውሂብ ጎታ ውስጥ ተብራርተው አግኝተናል።የእነዚህ ዒላማዎች ionክ ጥንካሬ ከተጋላጭነት ጊዜ ጋር ተመጣጣኝ ነው (ምስል 4c እና ተጨማሪ ምስል 9d).በ 2-ደቂቃ ቡድን ውስጥ ተለይተው የሚታወቁት ፕሮቲኖች የ GO ትንታኔ እንደሚያሳየው ተለይተው የሚታወቁት ፕሮቲኖች በኒውክሊየስ ውስጥ የተካተቱ እና በ chromatin ማሻሻያ እና በአር ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ተግባር ውስጥ ይሳተፋሉ.የፕሮቲን ሞለኪውላዊ ተግባር ከ BRD4 ተግባር (ምስል 4d) ጋር በሚጣጣም በ chromatin ማሰሪያ ወይም በጽሑፍ መገልበጥ የበለፀገ ነው።በሕብረቁምፊ ዳታቤዝ የነቃ የፕሮቲን መስተጋብር ትንተና በBRD4 እና HDAC ቤተሰብ መካከል እንደ SIN3A፣ NCOR2፣ BCOR እና SAP130 (ምስል 4e እና ተጨማሪ ምስል 9e) ከ BRD4 እና HDAC ማሰሪያ አሲቴላይትድ ሂስቶን ጋር በሚስማማ መልኩ በ BRD4 እና HDAC ቤተሰብ መስተጋብር መካከል የመጀመሪያ ደረጃ ቀጥተኛ ያልሆነ መስተጋብር አሳይቷል። ..በተጨማሪም፣ በ LC-MS/MS ተለይተው የታወቁ ኢላማዎች፣ Sin3A፣ NSUN2፣ Fus፣ እና SFPQ ጨምሮ፣ በምዕራባውያን መጥፋት (ምስል 4f) ተረጋግጧል።በቅርቡ፣ የ BRD4 አጭር አይሶፎርም ፈሳሽ-ፈሳሽ ደረጃ መለያየት (LLPS) ባህሪያት ያላቸው ኒዩክሊየይ እንደሚፈጥር ተዘግቧል።የአር ኤን ኤ ማሰሪያ ፕሮቲኖች Fus እና SFPQ የተለያዩ ሴሉላር ሂደቶችን LLPS ያገናኛሉ እና እዚህ ያልተመዘገቡ BRD4 ማሰሪያ ፕሮቲኖች ተደርገው ተለይተዋል።በ BRD4 እና SFPQ መካከል ያለው መስተጋብር በጋር-immunoprecipitation (co-IP) ሙከራዎች (ምስል 4g) የተረጋገጠ ሲሆን ይህም ለተጨማሪ ምርመራ የሚገባውን BRD4-መካከለኛ ፈሳሽ-ፈሳሽ ደረጃን ለመለየት ሌላ ዘዴን ይጠቁማል።እነዚህ ውጤቶች ሲደመር PDPL የታወቁ የBRD4 መስተጋብርን እና የማይታወቁ ተያያዥ ፕሮቲኖችን ለመለየት ምቹ መድረክ እንደሆነ ይጠቁማሉ።
የ miniSOG-መካከለኛ BRD4 የቀረቤታ ምልክት፣ የተጋላጭነት ጊዜ፡ 2፣ 5፣ 10 እና 20 ደቂቃ ውክልና።b በተለያዩ የብርሃን ጊዜያት ተለይተው የሚታወቁ ፕሮቲኖች መደራረብ።በHEK293T-miniSOG-BRD4 ውስጥ የተገለጸው የፕሮቲን ማበልፀግ ከዱር ዓይነት HEK293T ጋር ሲነጻጸር በስታቲስቲክስ ጉልህ ነው።በተጠቀሰው የተጋላጭነት ጊዜ ውስጥ ያልታወቁ ተወካዮች የታወቁ BRD4-ተያያዥ ፕሮቲኖችን በሚለካበት ጊዜ c ion ጥንካሬ።n = 3 ባዮሎጂያዊ ገለልተኛ ናሙናዎች.መረጃ እንደ አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ቀርቧል።d የጂን ኦንቶሎጂካል ትንተና (GO) በ 2 ደቂቃ ቡድን ውስጥ ተለይተው የሚታወቁ ፕሮቲኖች.የመጀመሪያዎቹ አስር የGO ውሎች ተዘርዝረዋል።አረፋዎች በ GO ቃል ምድብ መሰረት ቀለም አላቸው, እና የአረፋው መጠን በእያንዳንዱ ቃል ውስጥ ከሚገኙት ፕሮቲኖች ብዛት ጋር ተመጣጣኝ ነው.ከ BRD4 ጋር ስለሚገናኙ ፕሮቲኖች የ ሕብረቁምፊ ትንተና።ቢጫ ክበቦች ቀጥተኛ ሙጫ ናቸው እና ግራጫ ክበቦች ቀጥተኛ ያልሆነ ሙጫ የመጀመሪያው ንብርብር ናቸው.ቀይ መስመሮች በሙከራ የተቀመጡ ግንኙነቶችን ይወክላሉ እና ሰማያዊዎቹ መስመሮች የተተነበዩትን ግንኙነቶች ይወክላሉ.በኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ውስጥ ተለይተው የታወቁ የBRD4 አስገዳጅ ኢላማዎች በምዕራቡ መጥፋት ተረጋግጠዋል።g የጋራ መከላከያ ሙከራዎች በSFPQ እና BRD4 መካከል ያለውን መስተጋብር ያረጋግጣሉ።እነዚህ ሙከራዎች በተናጥል ቢያንስ ሁለት ጊዜ በተመሳሳይ ውጤት ተደግመዋል።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።
ያልተመዘገቡ ከPOI ጋር የተገናኙ ኢላማዎችን ከመለየት በተጨማሪ፣ ፒዲኤልኤል ለኤንዛይሞች ንኡስ ንጣፎችን ለመለየት ተስማሚ እንደሚሆን እንገምታለን፣ ይህም ያልተመዘገቡ ንኡስ ንጣፎችን ለማብራራት በትልልቅ ሕንጻዎች ውስጥ በተዘዋዋሪ የሚገናኙ ፕሮቲኖችን መለየት ይጠይቃል።ፓርኪን (በPARK2 ኮድ የተደረገ) E3 ligase ነው እና በፓርኪን ውስጥ የሚደረጉ ሚውቴሽን ራስን በራስ የማስተዳደር ሪሴሲቭ ጁቨኒል ፓርኪንሰን በሽታ (AR-JP)42 እንደሚያስከትል ይታወቃል።በተጨማሪም ፓርኪን ለ ሚቶፋጂ (ሚቶኮንድሪያል አውቶፋጂ) እና ምላሽ ሰጪ የኦክስጂን ዝርያዎችን ለማስወገድ አስፈላጊ እንደሆነ ተገልጿል.ይሁን እንጂ በርካታ የፓርኪን ንጥረነገሮች ተለይተው ቢታወቁም, በዚህ በሽታ ውስጥ የፓርኪን ሚና ግልጽ አይደለም.ያልተገለጡ ንብረቶቹን ለማብራራት፣ PDPL የተፈተነው ሚኒሶግ ወደ N- ወይም C-terminus የፓርኪን በማከል ነው።በPinK1-ፓርኪን መንገድ በኩል ፓርኪንን ለማንቃት ሴሎች በካርቦንዳይል ሲያናይድ ፕሮቶን ማጓጓዣ m-chlorophenylhydrazone (CCCP) ታክመዋል።ከ BRD4 PDPL ውጤታችን ጋር ሲነጻጸር፣ የፓርኪን ኤን-ተርሚነስ ውህደት ትልቅ የዒላማ ፕሮቲኖችን ስብስብ አሳይቷል፣ ምንም እንኳን ብዙ የC-terminusን (177 ከ210) የሚሸፍን ቢሆንም (ምስል 5a፣b እና ተጨማሪ መረጃ 4)።ውጤቱም N-terminal tags Parkin44 ን ሊያንቀሳቅሰው ይችላል ከሚለው ሪፖርቶች ጋር የሚስማማ ነው።የሚገርመው፣ በእኛ መረጃ ውስጥ ለፓርኪን43 የታተሙ የኤፒ-ኤምኤስ ውጤቶች ያላቸው 18 ተደራቢ ፕሮቲኖች ብቻ ነበሩ፣ ይህ ምናልባት በሴል መስመሮች እና ፕሮቲዮሚክስ የስራ ፍሰቶች መካከል ባለው ልዩነት ምክንያት ሊሆን ይችላል።በሁለት ዘዴዎች ከተለዩ አራት የታወቁ ፕሮቲኖች (ARDM1፣ HSPA8፣ PSMD14 እና PSMC3) በተጨማሪ (ምስል 5c)43።የኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ውጤቶችን የበለጠ ለማረጋገጥ፣ የፒዲኤልኤል ሕክምና እና ቀጣይ የምዕራባውያን መጥፋት የHEK293T የወላጅ ሴል ምርመራ እና የተረጋጋ N-terminal parkin line ውጤቶችን ለማነፃፀር ጥቅም ላይ ውለዋል።ከዚህ ቀደም ያልታወቁ ሲዲኬ2፣ DUT፣ CTBP1 እና PSMC4 ኢላማዎች በሚታወቀው ዲኤንኤጄቢ1 (ምስል 5d) ተፈትነዋል።
በእሳተ ገሞራ የፓርኪን መስተጋብር ፕሮቲኖች በ HEK293T ሴሎች ውስጥ በትንሹ SOG ከፓርኪን N- ወይም C-terminus ጋር የተዋሃዱ (n = 3 ገለልተኛ ባዮሎጂካል ሙከራዎች)።ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ በእሳተ ገሞራ ቦታዎች ላይ ጥቅም ላይ ውሏል።HEK293T እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውሏል. በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ (p <0.05 እና> 2-fold ion intensity ልዩነት) ተለይተዋል. በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ (p <0.05 እና> 2-fold ion intensity ልዩነት) ተለይተዋል. Значительно በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ ጎልተው ይታያሉ (p <0.05 እና> በ ion ጥንካሬ ውስጥ 2 እጥፍ ልዩነት).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно በከፍተኛ ሁኔታ የተለወጡ ፕሮቲኖች በቀይ ጎልተው ይታያሉ (p <0.05 እና > በ ion ጥንካሬ 2 እጥፍ ልዩነት)።ተዛማጅ ፕሮቲኖች ለHEK293T-miniSOG ጠቃሚ ነገር ግን ለHEK293T አስፈላጊ ያልሆኑ በአረንጓዴ ይታያሉ።b Venn ዲያግራም በኤን-ተርሚናል እና በሲ-ተርሚናል ግንባታዎች መካከል የተደራረቡ ፕሮቲኖችን ያሳያል።ኤን-ተርሚናል መለያዎች ፓርኪንን በተዛባ መልኩ ሊያነቃቁ እና የበለጠ ሊታወቁ የሚችሉ ፕሮቲኖችን ሊያስከትሉ ይችላሉ።c Venn ዲያግራም በPDPL እና AP-MS መካከል የተደራረቡ ፕሮቲኖችን ያሳያል።የታወቁ መስተጋብሮች ተዘርዝረዋል፣ 4 ከ18 ተደራራቢ ፕሮቲኖች እና 11 ከ159 ፕሮቲኖች በተለይ በPDPL ውስጥ ተለይተው ይታወቃሉ።d በኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ተለይተው የሚታወቁ ዒላማዎች በምዕራቡ መጥፋት ተረጋግጠዋል።e Ssu72 እና SNW1 ያልተመዘገቡ የፓርኪን ንጣፎች ተለይተዋል።እነዚህ FLAG መለያ የተደረገባቸው ፕሮቲን ፕላዝማይድ ወደ HEK293T እና HEK293T-ፓርኪን-ሚኒሶግ የተሸጋገሩ ሲሆን በተለያዩ ጊዜያት የCCCP ሕክምና ተላልፏል።በፓርኪን ከመጠን በላይ የመግለጫ መስመር ላይ ውርደቱ ይበልጥ ጎልቶ ነበር።ረ ፕሮቲሶም ኢንቢክተርን MG132 በመጠቀም፣ የ Ssu72 እና SNW1 የማሽቆልቆል ሂደት በፕሮቲሶም-በየትኛውም ቦታ መያዙ ተረጋግጧል።እነዚህ ሙከራዎች በተናጥል ቢያንስ ሁለት ጊዜ በተመሳሳይ ውጤት ተደግመዋል።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።
በተለይም፣ በPDPL ተለይተው የሚታወቁት ፕሮቲኖች ፓርኪን-ተያያዥ ፕሮቲኖችን እና ንብረቶቻቸውን ማካተት አለባቸው።ያልተመዘገቡ የፓርኪን ንጥረ ነገሮችን ለመለየት ሰባት ተለይተው የታወቁ ፕሮቲኖችን (PUF60፣PSPC1፣ UCHL3፣ PPP1R8፣ CACYBP፣ Ssu72 እና SNW1) እና የተለወጡ ፕላዝማይድን መርጠናል እነዚህን ጂኖች ወደ ተለመደው HEK293T ለማጋለጥ እና ሚኒሶግ-ፓርኪን HEK2CCCPT ተከትለውታል።በተረጋጋው ሚኒሶግ-ፓርኪን መስመር (ምስል 5e) የ Ssu72 እና SNW1 ፕሮቲኖች መጠን በእጅጉ ቀንሷል።በ CCCP ለ 12 ሰአታት የሚደረግ ሕክምና የሁለቱም ንጣፎች በጣም ከፍተኛ የሆነ መበላሸት አስከትሏል.የ Ssu72 እና SNW1 ማሽቆልቆል በፕሮቲዮሶም-በየትኛውም ቦታ ላይ ቁጥጥር የሚደረግ መሆኑን ለመመርመር, የፕሮቲሶም ኢንቢክተር MG132 የፕሮቲዮቲክ እንቅስቃሴን ለመከልከል ተጨምሯል, እና በእውነቱ የእነሱ የመበላሸት ሂደታቸው ታግዷል (ምስል 5f).ከኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ጋር የማይጣጣሙ ውጤቶችን የሚያሳየው የምዕራባውያን መጥፋትን (ተጨማሪ ምስል 10) በመጠቀም እንደ ፓርኪን መስተጋብሮች ተጨማሪ ያልተካተቱ ኢላማዎች ተረጋግጠዋል።በማጠቃለያው የፒ.ዲ.ኤል.ኤል የስራ ፍሰት ከታለመለት የፕሮቲን ሽግግር ማረጋገጫ ጋር መቀላቀል ያልተመዘገቡ E3 ligase substrates ለመለየት ያስችላል።
በህዋ እና በጊዜ መስተጋብር POIsን ለመለየት የሚያስችል የጋራ የቀረቤታ ምልክት ማድረጊያ መድረክ አዘጋጅተናል።መድረኩ በ miniSOG photosensitizer ፕሮቲን ላይ የተመሰረተ ሲሆን ይህም ወደ 12 ኪ.ዲ ብቻ ሲሆን ይህም ከበሰሉ APEX2 ኢንዛይም (27 ኪ.ዲ.) ከግማሽ ያነሰ እና በ TurboID (35 kDa) አንድ ሶስተኛው መጠን ነው.ትንሹ መጠን አነስተኛ የፕሮቲን መስተጋብሮችን ለማጥናት የመተግበሪያዎችን ክልል በእጅጉ ማስፋት አለበት።የነጠላ ኦክስጅንን የኳንተም ምርት ለመጨመር እና የዚህን አቀራረብ ስሜት ለማስፋፋት ተጨማሪ የፎቶሰንሲታይዘር፣ የጄኔቲክ ኮድ ያላቸው ፕሮቲኖችም ይሁኑ ትናንሽ ሞለኪውሎች ተጨማሪ ፍለጋ ያስፈልጋል።ለአሁኑ የ miniSOG ስሪት፣ የቅርበት ምልክቶችን ለማንቃት ሰማያዊ ብርሃንን በመጠቀም ከፍተኛ ጊዜያዊ ጥራት ማግኘት ይቻላል።በተጨማሪም ረዘም ያለ የተጋላጭነት ጊዜ ሰፋ ያለ ነጠላ ኦክሲጅን "ደመና" ይለቀቃል፣ በዚህም ምክንያት የርቀት ሂስታዲን ቅሪቶች ተስተካክለው፣ ራዲየስ መሰየሚያ ጨምሯል እና የ PDPL የቦታ መፍታትን ማስተካከል ይችላል።በተጨማሪም የሲግናል ወደ ዳራ ሬሾን ለመጨመር ሰባት ኬሚካላዊ ሙከራዎችን ሞከርን እና ከዚህ አካሄድ በስተጀርባ ያለውን ሞለኪውላዊ ዘዴ መርምረናል።የ TOP-ABPP የስራ ፍሰት ከአድልዎ-አልባ ክፍት ፍለጋ ጋር ተዳምሮ ማሻሻያዎች የተከሰቱት በሂስታዲን ውስጥ ብቻ እንደሆነ እና በ loop ክልል ውስጥ ላለው ሂስታዲን መጠነኛ ምርጫ ካልሆነ በስተቀር ለተጨማሪ የሂስታዲን ማሻሻያዎች ወጥ የሆነ ማይክሮ ኤንቬርመንት አልታየም።
ፒ.ዲ.ኤል.ኤል ንዑስ ሴሉላር ፕሮቲዮሞችን ከፕሮቲየም ስፔሲፊሺያልነት እና ሽፋን ጋር ቢያንስ ከሌሎች ቅርበት መሰየሚያ እና ከኦርጋኔል-ተኮር የኬሚካል መፈተሻ ዘዴዎች ጋር ሊወዳደር ይችላል።የቀረቤታ ምልክቶች እንዲሁ ላይ ላዩን፣ ሊሶሶማል እና ሚስጥራዊ ተያያዥ ፕሮቲዮሞች46፣47ን ለመለየት በተሳካ ሁኔታ ጥቅም ላይ ውለዋል።ፒዲኤልኤል ከእነዚህ ንዑስ ሴሉላር ኦርጋኔሎች ጋር ተኳሃኝ እንደሚሆን እናምናለን።በተጨማሪም፣ በተለዋዋጭ ባህሪያቸው እና በጊዜያዊ መስተጋብር ውስጥ በመሳተፋቸው ምክንያት ከሜምፕል ውስብስብ ፕሮቲኖች የበለጠ ውስብስብ የሆኑትን የሳይቲሶሊክ ፕሮቲን ትስስር ኢላማዎችን በመለየት ፒዲኤልኤልን ሞግተናል።ፒዲኤልኤል በሁለት ፕሮቲኖች ላይ ተተግብሯል፣ ግልባጭ አስተባባሪ BRD4 እና ከበሽታ ጋር የተገናኘ ሊጋዝ ኢ3 ፓርኪን።እነዚህ ሁለት ፕሮቲኖች የተመረጡት ለመሠረታዊ ባዮሎጂያዊ ተግባራቸው ብቻ ሳይሆን ለክሊኒካዊ ጠቀሜታ እና ለህክምና ችሎታም ጭምር ነው.ለእነዚህ ሁለት POI፣ የታወቁ አስገዳጅ አጋሮች እና ያልተመዘገቡ ኢላማዎች ተለይተዋል።በተለይም፣ የደረጃ መለያየት-የተገናኘ ፕሮቲን SFPQ በCo-IP የተረጋገጠ ሲሆን ይህም BRD4 (አጭር አይሶፎርም) LLPSን የሚቆጣጠርበትን አዲስ ዘዴ ሊያመለክት ይችላል።በተመሳሳይ ጊዜ, የፓርኪን ንጣፎችን መለየት በተዘዋዋሪ ማጣበቂያዎች መለየት የሚፈለግበት ሁኔታ ነው ብለን እናምናለን.ሁለት ማንነታቸው ያልታወቁ የፓርኪን ንኡስ ፕላስቲኮችን ለይተናል እና መበላሸታቸውን በየቦታው-ፕሮቲሶም መንገድ አረጋግጠናል።በቅርብ ጊዜ የሃይድሮላዝ ንኡስ ንጣፎችን በኢንዛይሞች በማጥመድ ዘዴን መሰረት ያደረገ የማጥመጃ ስልት ተዘጋጅቷል።ምንም እንኳን ይህ በጣም ኃይለኛ ዘዴ ቢሆንም, ትላልቅ ውስብስቦችን በመፍጠር ላይ ለሚሳተፉ ንጣፎችን ለመተንተን ተስማሚ አይደለም እና በኢንዛይም እና በንጥረ-ነገር መካከል ያለውን የጋርዮሽ ትስስር መፍጠርን ይጠይቃል.ሌሎች የፕሮቲን ውስብስቦችን እና የኢንዛይም ቤተሰቦችን ለምሳሌ እንደ ዴቡኩቲናሴ እና ሜታሎፕሮቴይዝ ቤተሰቦች ለማጥናት ፒዲኤልኤል ሊራዘም እንደሚችል እንጠብቃለን።
SOPP3 የሚባል አዲስ የሚኒሶግ አይነት በተሻሻለ ነጠላ ኦክሲጅን ምርት ተዘጋጅቷል።ሚኒሶግን ከSOPP3 ጋር አወዳድረን የተሻሻለ የማርክ ማድረጊያ አፈጻጸም አግኝተናል፣ ምንም እንኳን የሲግናል-ወደ-ጫጫታ ጥምርታ ሳይለወጥ ቢቆይም (ተጨማሪ ምስል 11)።የ SOPP3 ማመቻቸት (ለምሳሌ በተመራ ዝግመተ ለውጥ) ይበልጥ ቀልጣፋ የፎቶሴንቲዘርዘር ፕሮቲኖች አጭር የብርሃን ጊዜ የሚያስፈልጋቸው እና በዚህም የበለጠ ተለዋዋጭ ሴሉላር ሂደቶችን ለመያዝ ያስችላል ብለን ገምተናል።በተለይም የአሁኑ የፒዲኤልኤል እትም በሴሉላር አካባቢ የተገደበ ነው ምክንያቱም ሰማያዊ ብርሃን ማብራት ስለሚያስፈልገው እና ​​ወደ ጥልቅ ቲሹዎች ውስጥ ዘልቆ መግባት አይችልም.ይህ ባህሪ በእንስሳት ሞዴል ጥናቶች ውስጥ መጠቀምን ይከለክላል.ይሁን እንጂ የኦፕቶጄኔቲክስ ከፒዲኤልኤል ጋር መቀላቀል በተለይ በአንጎል ውስጥ ለእንስሳት ምርምር እድል ሊሰጥ ይችላል.በተጨማሪም፣ ሌሎች የምህንድስና ኢንፍራሬድ ፎተሴንቲዘርሮችም ይህንን ገደብ ያስወግዳሉ።በአሁኑ ጊዜ በዚህ አካባቢ ምርምር እየተካሄደ ነው.
የHEK293T ሕዋስ መስመር የተገኘው ከ ATCC (CRL-3216) ነው።የሴሉ መስመር ለ mycoplasma ኢንፌክሽን አሉታዊ ሆኖ ተገኝቷል እና በዲኤምኤም (ቴርሞ, #C11995500BT) በ 10% የፅንስ ቦቪን ሴረም (FBS, Vistech, #SE100-B) እና 1% ፔኒሲሊን / ስትሬፕቶማይሲን (Hyclone, #SV30010) ተጨምሯል.ውስጥ አድጓል።
3-Aminophenylene (ናሙና 3) እና (4-ethynylphenyl) ሜታናሚን (ናሙና 4) የተገዙት ከBidepharm ነው።ፕሮፒላሚን (ፕሮብ 2) የተገዛው ከኃይል-ኬሚካሎች ነው.N- (2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) በታተሙ ዘዴዎች መሰረት ተካቷል.
ማሟያ ሠንጠረዥ 1 በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉ የጄኔቲክ ግንባታዎችን ይዘረዝራል.የ miniSOG እና KillerRed ቅደም ተከተሎች ከፒ.ዙዩ (ፔኪንግ ዩኒቨርሲቲ) ከተሰጠው ስጦታ ፕላዝማድ ተሸፍነዋል።ማይቶኮንድሪያል ማትሪክስ ኢላማ አድራጊ ቅደም ተከተል ከ23 N-terminal አሚኖ አሲዶች COX4 የተገኘ እና የጊብሰን ስብሰባን (Beyotime, #D7010S) በመጠቀም ወደ ተጠቁሙት ቬክተሮች ተቀላቀለ።የኢንዶፕላዝሚክ ሬቲኩለም ሽፋንን እና አስኳል ላይ ለማነጣጠር SEC61B የሰው ዲ ኤን ኤ (NM_006808.3) (NEB፣ #M0491L) በ PCR የተጨመረው ከ HEK293T ሴሎች የሲዲኤንኤ ቤተመፃሕፍት እና H2B DNA (በዲ ሊን ፣ ሼንዘን ቤይ ላብራቶሪ የተበረከተ) እና ክሎኒድ, ከላይ እንደተጠቀሰው.በሌላ መልኩ ካልተገለጸ በቀር፣ ሌሎች የፕሮቲን ጂኖች ለመተላለፍ እና የተረጋጋ የሕዋስ መስመሮችን ለመገንባት የሚያገለግሉት PCR ከHEK293T ሕዋስ ሲዲኤንኤ ቤተ-መጽሐፍት ተጨምሯል።G3S (GGGS) እና G4S (GGGGS) ባይት ፕሮቲን እና miniSOG መካከል እንደ ማያያዣዎች ጥቅም ላይ ውለዋል።በእነዚህ የውህደት ግንባታዎች ላይ የV5 ኤፒቶፕ መለያ (GKPIPNPLLGLDST) ተጨምሯል።በአጥቢ እንስሳት ውስጥ ለመግለፅ እና የተረጋጋ የሕዋስ መስመርን ለመመስረት ፣የሚኒሶግ ውህደት ግንባታ በ pLX304 lentiviral ቬክተር ውስጥ ተሰርቷል።ለባክቴሪያ አገላለጽ፣ miniSOG በ C-terminus ላይ 6xHis ወደተሰየመው pET21a ቬክተር ተዘግቷል።
HEK293T ሴሎች በደንብ በ 2.0 x 105 ሴሎች በስድስት ጉድጓድ ውስጥ ተዘርተዋል እና ከ 24 ሰዓታት በኋላ በሪኮምቢንታል ሌንቲቫይራል ፕላዝማይድ (2.4 μg pLX304) እና በቫይራል ማሸጊያ ፕላስሲዶች (1.5 μg psPAX2 እና 1.2 μግ) ፒኤምዲ በመጠቀም ተላልፈዋል። ፣ #C0533) ፣ ወደ 80% ውህደት።ከአንድ ምሽት ሽግግር በኋላ, መካከለኛው ተቀይሮ ለሌላ 24 ሰአታት ተተክሏል.የቫይረሱ ስርጭት የተካሄደው ከ24፣48 እና 72 ሰአታት በኋላ ነው።የታለመው የሴል መስመሮች ከመበከላቸው በፊት, የቫይረሱ መካከለኛ በ 0.8 μm ማጣሪያ (ሜርክ, #ሚሌክስ-ጂፒ) እና ፖሊብሬን (ሶላርቢዮ, #H8761) በ 8 μg / ml ውስጥ ተጨምሯል.ከ 24 ሰአታት በኋላ ሴሎቹ መካከለኛውን በመለወጥ እንዲመለሱ ተፈቅዶላቸዋል.ህዋሶች በመጀመሪያዎቹ ሶስት ምንባቦች 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) እንደ ዝቅተኛ ጥብቅ ምርጫ በመጠቀም ተመርጠዋል።ከዚያም ለቀጣዮቹ ሶስት ምንባቦች 20 μg / ml እንደ ተጨማሪ ጥብቅ ስርዓት ይጠቀሙ.
በአንድ ጉድጓድ በግምት 20,000 ህዋሶች ጥግግት ላይ በ12-ጉድጓድ ክፍሎች (Ibidi, #81201) ሴሎች ተዘርተዋል።የHEK293T ሴሎችን መገጣጠም ለማሻሻል 50 µg/ml ፋይብሮኔክቲን (ኮርኒንግ፣ #356008) በፎስፌት ባፈርድ ሳላይን (PBS፣ Sangon፣ #B640435) በ 37°ሴ የተበረዘ ይጨምሩ።ክፍሎቹ ለ 1 ሰዓት ቀድመው ተወስደዋል ከዚያም በፒቢኤስ ተወግደዋል.ከ 24 ሰአታት በኋላ ህዋሶች አንድ ጊዜ በፒ.ቢ.ኤስ ይታጠባሉ ፣ በ 1 mM probe 3 በአዲስ የሃንክስ ሚዛናዊ የጨው መፍትሄ (HBSS ፣ Gibco ፣ # 14025092) ለ 1 ሰአታት በ 37 ° ሴ ፣ እና ከዚያ በሰማያዊ LED (460 nm) ይታከላሉ ። ).) በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች ተበክለዋል.ከዚያ በኋላ ሴሎቹ በፒቢኤስ ሁለት ጊዜ ታጥበው በ 4% ፎርማለዳይድ በ PBS (ሳንጎን, # E672002) በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 15 ደቂቃዎች ተስተካክለዋል.ከመጠን በላይ ፎርማለዳይድ በፒቢኤስ ሶስት ጊዜ በመታጠብ ከተስተካከሉ ሴሎች ተወግዷል.ከዚያም ሴሎች በ 0.5% ትሪቶን X-100 (ሳንጎን, #A600198) በፒ.ቢ.ኤስ ተበክተው 3 ጊዜ በፒቢኤስ ታጥበዋል.ከዚያም ክፍሉን ያስወግዱ እና በእያንዳንዱ ናሙና ውስጥ 25 µl የጠቅታ ምላሽ ቅልቅል ይጨምሩ 50 µM Cy3-azide (አላዲን፣ #C196720) እና 0.5 mg / ml ሶዲየም ascorbate (አላዲን, ቁ. S105024) እና ለ 30 ደቂቃዎች በቤት ሙቀት ውስጥ መጨመር.ፈጣን ምላሽ ከተሰጠ በኋላ ሴሎች 0.05% Tween-20 (ሳንጎን፣ #A600560) (PBST) በያዙ PBS ስድስት ጊዜ ታጥበው ከዚያም በ5% BSA (Abcone, #B24726) በPBST ውስጥ በክፍል ሙቀት ለ30 ደቂቃዎች ታግደዋል።
ለኮሎካልላይዜሽን የበሽታ መከላከያ ህዋሶች በተጠቀሱት ሁኔታዎች መሰረት ከዋና ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ተጨምረዋል-መዳፊት ፀረ-V5 መለያ mAb (1:500, CST, #80076), ጥንቸል ፀረ-Hsp60 mAB (1:1000), ABclonal, #A0564), ጥንቸል ፖሊክሎናል ፀረ-ካልኔክሲን ፀረ እንግዳ አካላት (1:500, Abcam, #ab22595) ወይም ጥንቸል ፀረ-ላሚን ኤ/ሲ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (1:500; CST, #2032) በአንድ ምሽት 4 ° ሴ.በPBST 3 ጊዜ ከታጠበ በኋላ ሴሎቹ በሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ተፈጥረዋል፡ ፍየል ፀረ-ጥንቸል Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) ተበርዟል 1:1000, ፍየል ፀረ-አይጥ Alexa Fluor 594 (CST, #8889) በ 1:1000 ተጨምሯል.ማቅለጫ ለ 30 ደቂቃዎች በቤት ውስጥ ሙቀት ውስጥ ይቀንሱ.ከዚያም ሴሎቹ በPBST 3 ጊዜ ታጥበው በDAPI (Thermo, #D1306) በPBS ውስጥ ለ10 ደቂቃ በክፍል ሙቀት ተደርገዋል።ከ 3 በፒቢኤስ ጋር ከታጠበ በኋላ ህዋሶች በ 50% glycerol (ሳንጎን, #A600232) በፒቢኤስ ውስጥ ለምስል ተዘግተዋል.Immunofluorescent ምስሎች የተገኙት ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope እና ZNE 3.5 ሶፍትዌርን በመጠቀም ነው።
ለነጠላ ኦክሲጅን ፍሎረሰንት ምስል 100 nM Si-DMA በ Hanks HEPES ቋት (DOJINDO, #MT05) ከመጨመራቸው በፊት በ Hanks HEPES ቋት ሁለት ጊዜ ታጥበዋል.ለብርሃን ከተጋለጡ በኋላ ሴሎቹ በ CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 45 ደቂቃዎች ተወስደዋል.ከዚያም ሴሎቹ ሁለት ጊዜ በሃንክስ HEPES ቋት ታጥበው በሃንክስ HEPES ቋት ውስጥ ለ10 ደቂቃ ያህል በሆቼስት ተሸፍነው በክፍል ሙቀት እና በZEISS LSM 900 confocal ማይክሮስኮፕ ተጠቅመዋል።, #M36008) ካልሲየም እና ማግኒዚየም በያዘ HBSS ቋት ውስጥ።ለብርሃን ወይም ዶክሶሩቢሲን (MCE, #HY-15142A) ከተጋለጡ በኋላ, ሴሎች በ CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ በ 37 ° C. ለ 10 ደቂቃዎች, በ HBSS ቋት ሁለት ጊዜ ታጥበው እና በ HBSS ቋት ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ በ Hoechst ተክለዋል.ደቂቃዎች ።Doxorubicin ህዋሶች በ 20 μM doxorubicin በ HBSS ውስጥ 1% BSA በያዙ ለ 30 ደቂቃዎች ሲታከሙ እንደ አወንታዊ መመርመሪያ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውሏል።Immunofluorescent ምስሎች የዚስ LSM 900 ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ በመጠቀም ተገኝተዋል።
HEK293T ህዋሶች ሚቶ-ሚኒሶግን በትክክል የሚገልፁት በ15 ሴ.ሜ ምግቦች ውስጥ በግምት 30% በሆነ ጥግግት ላይ ተዘርተዋል።ከ 48 ሰአታት በኋላ ~ 80% መጋጠሚያ ሲደረስ ሴሎቹ አንድ ጊዜ በፒ.ቢ.ኤስ ይታጠባሉ ፣ በ 1 mM Probe 3 በአዲስ HBSS ቋት ውስጥ ለ 1 ሰዓት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ተተክለው ከዚያም በክፍሉ ውስጥ ለ 10 ደቂቃዎች በሰማያዊ ኤልኢዲ ይብራራሉ ። የሙቀት መጠን..ከዚያ በኋላ፣ ሴሎቹ ሁለት ጊዜ በፒቢኤስ ታጥበው፣ በበረዶ-ቀዝቃዛ ፒቢኤስ ቋት ውስጥ ከ EDTA-ነጻ ፕሮቲን-ኢንጂነሮች (MCE፣ #HY-K0011) ጋር እንደገና ታግደዋል።ጫፉን ለ 1 ደቂቃ (1 ሰከንድ በርቶ እና 1 ሰከንድ በ 35% ስፋት) ጫፉን በድምፅ በማንሳት ሴሎች ተረግጠዋል።የተገኘው ድብልቅ በ 15,871 xg ለ 10 ደቂቃ በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ፍርስራሹን ለማስወገድ እና ከመጠን በላይ መጠኑ በ BCA ፕሮቲን መመርመሪያ ኪት (Beyotime, #P0009) በመጠቀም ወደ 4 mg / mL ተስተካክሏል.ከላይ የተጠቀሰው ሊዛት 1 ሚሊር ከ 0.1 ሚ.ሜትር የፎቶግራዳዳድ ባዮቲን አዚድ (ኮንፍሉሬ፣ #BBBD-14)፣ 1 ሚሜ TCEP (ሳንጎን፣ #A600974)፣ 0.1 ሚሜ ቲቢቲኤ ሊጋንድ (አላዲን፣ #T162437) እና 1 mMMtor CuSO4 ጋር ያዋህዱ። በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 1 ሰዓት ማዞር.ፈጣን ምላሽ ከተሰጠ በኋላ ድብልቁን ወደ ቀድሞው የተቀላቀለ መፍትሄ (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) በ 10 ሚሊር ብርጭቆ ብርጭቆ ውስጥ ይጨምሩ.ናሙናዎቹ በ 4500 ግራም ለ 10 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ተቀላቅለው በሴንትሪፉድ ተቀምጠዋል.የታችኛው እና የላይኛው መፍትሄዎች ተጥለዋል, ዝናቡ በ 1 ሚሊ ሜትር ሜታኖል ሁለት ጊዜ ታጥቧል እና በ 15871 × g ለ 5 ደቂቃዎች በ 4 ° ሴ.በ 25 ሚ.ሜትር አሚዮኒየም ባይካርቦኔት (ABC, Aladdin, No. A110539) ውስጥ 1 ሚሊ ሜትር የ 8 M ዩሪያ (አላዲን, ቁጥር U111902) አክል.ናሙናዎች በ 10 mM dithiothreitol (ሳንጎን, # A100281 በ 25 ሚሜ ኤቢሲ) ለ 40 ደቂቃዎች በ 55 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና 15 ሚሜ ትኩስ iodoacetamide (ሳንጎን, # A600539) በጨለማ ክፍል ውስጥ ተጨምረዋል.በ 30 ደቂቃዎች ውስጥ አልኪላይሽን..ምላሹን ለማስቆም ተጨማሪ 5 ሚሜ ዲቲዮትሬይቶል ተጨምሯል።በግምት 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) ለእያንዳንዱ ናሙና በ 1 ml PBS 3 ጊዜ በመታጠብ ያዘጋጁ።ከላይ ያለው የፕሮቲን መፍትሄ በ 5 ml PBS ተጨምሯል እና በቅድመ-ታጠበ የ NeutrAvidin agarose ዶቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 4 ሰዓታት ተጨምሯል.ከዚያም ዶቃዎቹ 3 ጊዜ በ 5 ml PBS 0.2% SDS (ሳንጎን, # A600485), 3 ጊዜ በ 5 ml PBS 1M ዩሪያ እና 3 ጊዜ በ 5 ml ddH2O.ከዚያም ዶቃዎቹ በሴንትሪፍጋሽን ተሰብስበዋል እና በ 200 μl 25 mM ABC ውስጥ 1 M ዩሪያ፣ 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) እና 20 ng/μl ትራይፕሲን (Promega, #V5280) በያዙት እንደገና እንዲታገዱ ተደርጓል።በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ የሙቀት መጠን በማዞር በአንድ ሌሊት ይሞክሩ።ፒኤች 2-3 እስኪደርስ ድረስ ፎርሚክ አሲድ (ቴርሞ፣ # A117-50) በመጨመር ምላሹ ቆሟል።ዶቃዎቹ 3 ጊዜ በ 1 ml PBS በ 0.2% SDS, 3 ጊዜ በ 1 ml PBS 1 M ዩሪያ እና ከዚያም 3 ጊዜ በ 1 ሚሊ ሜትር የተጣራ ውሃ.የተሻሻሉ peptides በብርሃን ሊሲስ (365 nm) ለ 90 ደቂቃዎች በ 200 μl 70% MeOH በመጠቀም ተለቀቁ.ከሴንትሪፉግ በኋላ, የሱፐርኔቱ ተሰብስቧል.ከዚያም ዶቃዎቹ በ 100 μl 70% MeOH አንድ ጊዜ ታጥበው እና ከፍተኛ መጠን ያለው ንጥረ ነገር ተጣብቀዋል.ናሙናዎች በSpeedvac vacuum concentrator ውስጥ ደርቀው እስከ -20°C ድረስ ተከማችተዋል።
ነጠላ ኦክሲጅን የተሻሻሉ peptides ለመለየት እና ለመለካት ናሙናዎች በ 0.1% ፎርሚክ አሲድ እና 1 μg peptides እንደገና ተፈትተዋል Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer ከ Tune እና Xcalibur ከሻጭ ሶፍትዌር 4.3 የተገጠመለት።ናሙናዎች በ 75 µm × 15 ሴ.ሜ ውስጣዊ የታሸገ የካፒታል አምድ ከ 3 μm C18 ቁሳቁስ (ReproSil-pur, #r13.b9.) እና ከ EASY-nLC 1200 UHPLC ሲስተም (ቴርሞ) ጋር ተገናኝተዋል።peptides በመስመራዊ የ95 ደቂቃ ቀስ በቀስ ክሮማቶግራፊ ከ 8% ሟሟ ቢ እስከ 50% ሟሟ ቢ (A = 0.1% ፎርሚክ አሲድ በውሃ ውስጥ፣ B = 0.1% ፎርሚክ አሲድ በ 80% አሴቶኒትሪል) ተለያይተዋል፣ ከዚያም ቀጥታ ወደ 98% B ደቂቃ ጨምሯል። በ 6 ደቂቃ ውስጥ በ 300 nl / ደቂቃ ፍሰት ፍጥነት.ኦርቢትራፕ ፊውዥን ሉሞስ በመረጃው ላይ ተመስርተው በሙሉ ኤምኤስ ስካን እና MS2 ቅኝት መካከል ተለዋጭ መረጃ ይሰበስባል።የስፕቲንግ ቮልቴጅ ወደ 2.1 ኪ.ቮ እና የ ion ማጓጓዣ ካፕላሪ ሙቀት 320 ° ሴ.MS spectra (350-2000 m/z) የተሰበሰበው በ120,000፣ AGC 4 × 105 ጥራት እና ከፍተኛው የግቤት ጊዜ 150 ሚሴ ነው።በእያንዳንዱ ሙሉ ቅኝት ውስጥ ያሉት 10 በጣም የተለመዱ ተባዝተው ቻርጆች ኤች.ሲ.ዲ.ን ከመደበኛ የግጭት ሃይል 30%፣ ባለአራት እጥፍ ማግለል መስኮት 1.6 ሜ/ዜ እና 30,000 የጥራት ቅንጅት ተከፋፍለዋል።5×104 እና ከፍተኛውን የግቤት ጊዜ 150 ሚሴ በመጠቀም የታንዳም mass spectrometry የAGC ኢላማ።ተለዋዋጭ ልዩነቱ ወደ 30 ሰከንድ ተቀናብሯል። ያልተመደቡ ionዎች ወይም 1+ እና>7+ ክፍያ ያላቸው ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል። ያልተመደቡ ionዎች ወይም 1+ እና>7+ ክፍያ ያላቸው ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል። Неназначеные ионы или ионы с zaryadom 1+ እና >7+ ባይሊ отклонены для МС/МС. ያልተመደቡ ions ወይም ionዎች ከ1+ እና >7+ ክፍያ ጋር ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል።未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуkazannыe ионы или ионы с zaryadamy 1+ እና >7+ ባይሊ отклонены дlia МС/МС. ያልተገለጹ ionዎች ወይም ionዎች ከ1+ እና > 7+ ክሶች ጋር ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል።
ጥሬው መረጃ በMSFragger ላይ የተመሰረተ FragPipe ኮምፒውቲንግ መድረክን በመጠቀም ነው የሚሰራው።የጅምላ አድልኦዎች እና ተዛማጅ አሚኖ አሲዶች የሚወሰኑት ከ -150 እስከ 500 ዳ ከቅድመ ጅምላ መቻቻል ጋር ክፍት የፍለጋ ስልተ-ቀመር በመጠቀም ነው።ከዚያም የተሻሻሉ peptides የሂስታዲን ማሻሻያዎችን በመጠቀም በ +229.0964 እና +247.1069 ዳ በፒዲ (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) ከፍተኛ ትርፍ አግኝተዋል።
የተዋሃደውን miniSOG ጂን በተረጋጋ ሁኔታ የሚገልጹ ሴሎች በ6 ሴ.ሜ ምግቦች ተለጥፈዋል።~80% መጋጠሚያ ላይ ሲደርሱ፣ሴሎች አንድ ጊዜ በHBSS (ጊብኮ፣ #14025092) ታጥበዋል፣ ከዚያም በHBSS ውስጥ በኬሚካል መፈተሻዎች ለ1 ሰአት በ37°ሴ እና በሰማያዊ ብርሃን ተበራክተዋል።በክፍል ሙቀት ውስጥ 10 ዋ LED ለ 20 ደቂቃዎች።በፒዲኤልኤል ውስጥ የትኛው ዓይነት ምላሽ ሰጪ የኦክስጂን ዝርያዎች እንደሚሳተፉ ለመወሰን 0.5 ሚሜ ቪታሚን ሲ (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 ሚሜ ማኒቶል (ኢነርጂ ኬሚካል, # 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ወደ ሴሎች እንደ ተጨማሪዎች ተጨምረዋል.በቀዝቃዛ ፒቢኤስ ከታጠበ በኋላ ህዋሶች ተጠርገው ፣ በ 1.5 ሚሊ ሜትር ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች ውስጥ ተሰብስበዋል ፣ እና ለ 1 ደቂቃ ከጫፍ ጋር በ 200 μl ፒቢኤስ ከ 1 x ፕሮቲሴስ መከላከያ ጋር ያለ EDTA (1 s እና 1 s without, amplitude 35%).የተገኘው ድብልቅ በ 15,871 × g ለ 10 ደቂቃ በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና በ BCA ፕሮቲን መመርመሪያ ኪት በመጠቀም የሱፐርኔሽን ክምችት ወደ 1 mg / mL ተስተካክሏል.ከላይ ከተጠቀሰው ሊዛት ውስጥ በግምት 50 µl በ 0.1 ሚሜ ሮዳሚን አዚድ (አላዲን ፣ ቁ. T131368) ፣ 1 ሚሜ TCEP ፣ 0.1 ሚሜ ቲቢቲኤ ሊጋንድ እና 1 mM CuSO4 በክፍል ሙቀት ውስጥ ከታች ወደ ላይ በማሽከርከር ለ 1 ሰዓት ተተክሏል።ከጠቅታ ምላሽ በኋላ የዝናብ መጠን በ 250 μl ቅድመ-የቀዘቀዘ አሴቶን ወደ ናሙናዎች በመጨመር በ -20 ° ሴ ለ 20 ደቂቃዎች እና በ 6010 × g በ 6010 × g ለ 10 ደቂቃ በ 4 ° ሴ.እንክብሉን ይሰብስቡ እና በ 50 μl 1x Laemmli's ቋት ውስጥ ለ 10 ደቂቃ በ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ይቀቅሉት።ናሙናዎች በSDS-PAGE ረጅም ጂልስ ላይ ተተንትነው የባዮ-ራድ ኬሚ ዶክ ኤም ፒ ንካ ኢሜጂንግ ሲስተም በምስል ላብ ንክኪ ሶፍትዌር በመጠቀም ታይተዋል።
የ recombinant miniSOG-6xHis ፕሮቲን መግለጫ እና ማጽዳት ቀደም ሲል እንደተገለፀው ተካሂዷል.በአጭሩ ኢ.ኮሊ BL21 (DE3) ሴሎች (TransGen, #CD701-02) በ pET21a-miniSOG-6xHis ተለውጠዋል እና የፕሮቲን አገላለጽ በ 0.5 mM IPTG (ሳንጎን, # A600168) ተለውጧል.ከሴል ሊሲስ በኋላ ፕሮቲኖች በኒ-ኤንቲኤ አጋሮዝ ዶቃዎች (ኤምሲኢ፣ ቁጥር 70666)፣ በፒቢኤስ ላይ ተመርተው እና በ -80 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ተከማችተዋል።
ለፀረ-ሰው-ተኮር ኢን ቪትሮ መለያ ቅርበት ጥናት፣ 100 μM የተጣራ miniSOG፣ 1 mM probe 3 እና 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) በPBS ውስጥ ወደ አጠቃላይ ምላሽ መጠን 50 μl ይቀላቅሉ።.የምላሹ ድብልቅ በሰማያዊ ኤልኢዲ መብራት ለ 0፣ 2፣ 5፣ 10 እና 20 ደቂቃ በክፍል ሙቀት ተበርዟል።ድብልቁ በ 0.1 ሚሜ ባዮቲን-PEG3-azide (አላዲን, # B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand እና 1 mM CuSO4 በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 1 ሰአታት ወደ ላይ በሚንቀሳቀስ እንቅስቃሴ ላይ ተተክሏል.ፈጣን ምላሽ ከተሰጠ በኋላ 4x Laemmli ቋት በቀጥታ ወደ ድብልቅው ውስጥ ይጨምሩ እና በ 95 ° ሴ ለ 10 ደቂቃዎች ያብስሉት።ናሙናዎች በኤስዲኤስ-ገጽ ጄል ላይ ተተንትነዋል እና በምዕራባዊው መጥፋት በ streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) ተተነተኑ።
ሂስቲዲን የያዘ ሰው ሰራሽ peptide ከ C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) ጋር በአቅራቢያው ያለ peptide-based in vitro መለያን ለመተንተን ጥቅም ላይ ውሏል።በዚህ ሙከራ 100 μM የተጣራ ሚኒሶግ፣ 10 ሚሜ ፕሮብ 3 እና 2 μg/ml ሰራሽ ፔፕታይድ በፒ.ቢ.ኤስ በጠቅላላ ምላሽ መጠን 50 μl ውስጥ ተቀላቅሏል።የምላሹ ድብልቅ በሰማያዊ ኤልኢዲ መብራት በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 1 ሰዓት ተሞልቷል።አንድ ማይክሮ ሊትር ናሙና በኤልሲ-ኤምኤስ ሲስተም (ውሃ፣ SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer with MassLynx spectrum analysis software) በመጠቀም ተንትኗል።
የHEK293T ሴሎች የሚኒሶግ ውህደት ጂንን በ10 ሴ.ሜ ምግቦች ውስጥ ለተለያዩ የኦርጋን ለትርጉም መስመሮች (ሚቶ፣ ER፣ ኒውክሊየስ) እና 15 ሴ.ሜ ምግቦች ለፓርኪን-ሚኒሶግ እና BRD4-ሚኒሶግ መስመሮች ተዘርተዋል።~90% መጋጠሚያ ላይ ሲደርሱ ሴሎቹ አንድ ጊዜ በHBSS ይታጠባሉ ከዚያም በ HBSS ውስጥ በ probe 3 ለ 1 ሰዓት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ እና በ 10 ዋ ሰማያዊ ኤልኢዲ በክፍሉ የሙቀት መጠን እንዲበሩ ይደረጋል።ለፓርኪን ግንኙነት ላልሆነ መለያ፣ 10 µM ፕሮቶን ካርቦንይልል ሳይናይይድ ተሸካሚ m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) በ HBSS ውስጥ ለ 1 ሰዓት በ 37 ° ሴ ተጨምሯል።የሴል ሊሲስ፣ የክሊክ ኬሚስትሪ፣ የመቀነስ እና የአልኪላይዜሽን እርምጃዎች ከላይ እንደተገለፀው ተመሳሳይ ነበሩ፣ ካልሆነ በስተቀር 2 ሚሊ ግራም ሊዛት ከመጨመሩ እና ባዮቲን PEG3 አዚድ በፎቶ-degradadable ባዮቲን አዚድ ምትክ በጠቅታ ምላሽ ውስጥ ጥቅም ላይ ውሏል።ከበለጸጉ በኋላ ዶቃዎቹ 3 ጊዜ በ 5 ml PBS 0.2% SDS, 3 ጊዜ 5 ml PBS 1 M ዩሪያ እና 3 ጊዜ በ 5 ml PBS ይታጠባሉ.ከዚያ በኋላ 2 μg ትራይፕሲን በ 300 μl 25 ሚሜ ኤቢሲ ውስጥ 1 ኤም ዩሪያ ያለው ፕሮቲን በአንድ ሌሊት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ይሰበራል።ፒኤች 2-3 እስኪደርስ ድረስ ፎርሚክ አሲድ በመጨመር ምላሹ ቆሟል።ዶቃዎች ላይ ትራይፕሲን ከተሰራ በኋላ የፔፕታይድ መፍትሄ በ SOLAµ HRP አምድ (ቴርሞ፣ #60209-001) በመጠቀም ተደምስሷል እና በSpedivac vacuum concentrator ውስጥ ደርቋል።ፔፕቲዶች በ 0.1% ፎርሚክ አሲድ እና 500 ng peptides ውስጥ እንደገና ተፈትተዋል ኦርቢትራፕ ፊውዥን Lumos Tribrid mass spectrometer ከላይ በተገለጸው የናኖ-ESI ምንጭ የተገጠመ ነው።Peptides በንግድ RP-HPLC ቅድመ አምዶች (75 μm x 2 ሴ.ሜ) (ቴርሞ፣ ቁጥር 164946) እና ትንታኔያዊ RP-HPLC አምዶች (75 μm x 25 ሴ.ሜ) (ቴርሞ፣ ቁ. 164941)፣ ሁለቱም በ2 μm ተሞልተዋል።ቀስ በቀስ ከ 8% ወደ 35% ACN በ 60 ደቂቃዎች ውስጥ, ከዚያም በመስመር ወደ 98% B በ 6 ደቂቃዎች ውስጥ በ 300 Nl / ደቂቃ ፍሰት ፍጥነት ጨምሯል.MS spectra (350-1500 m/z) የተሰበሰበው በ60,000፣ AGC 4 × 105 ጥራት እና ከፍተኛው የግብዓት ጊዜ 50 ሚሴ ነው።የተመረጡት ionዎች በቅደም ተከተል በኤችሲዲ በ 3 ዑደቶች የተከፋፈሉ ሲሆን በተለመደው የግጭት ሃይል 30% ፣ ባለአራትዮሽ ማግለል መስኮት 1.6 ሜ/ዜ እና 15000 ጥራት። 5 × 104 የታንዳም የጅምላ ስፔክትሮሜትር AGC ዒላማ እና ከፍተኛው የመርፌ ጊዜ የ 22 ms ጥቅም ላይ ውሏል.ተለዋዋጭ ማግለሉ ወደ 45 ሰከንድ ተቀናብሯል። ያልተመደቡ ionዎች ወይም 1+ እና>7+ ክፍያ ያላቸው ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል። ያልተመደቡ ionዎች ወይም 1+ እና>7+ ክፍያ ያላቸው ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል። Неназначеные ионы или ионы с zaryadom 1+ እና >7+ ባይሊ отклонены для МС/МС. ያልተመደቡ ions ወይም ionዎች ከ1+ እና >7+ ክፍያ ጋር ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል።未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуkazannыe ионы или ионы с zaryadamy 1+ እና >7+ ባይሊ отклонены дlia МС/МС. ያልተገለጹ ionዎች ወይም ionዎች ከ1+ እና > 7+ ክሶች ጋር ለኤምኤስ/ኤምኤስ ውድቅ ተደርገዋል።
የናሙና ዝግጅት ደረጃዎች ወደ NeutrAvidin ዶቃዎች ማበልጸግ ከላይ በተገለጸው የኤልሲ-ኤምኤስ/ኤምኤስ ትንተና ተመሳሳይ ናቸው።በግምት 50 μg lysate ለጭነት መቆጣጠሪያ እንደ ግብአት ጥቅም ላይ የዋለ ሲሆን 2 mg lysate ደግሞ ለጠቅ ምላሾች ጥቅም ላይ ይውላል።በኒውትራቪዲን ከበለፀጉ እና ከታጠበ በኋላ የታሰሩ ፕሮቲኖች 50 μል የላምሊ ቋት ወደ አጋሮዝ ሙጫ ዶቃዎች በመጨመር እና በ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች በማፍላት ይለቃሉ።የቁጥጥር ሎድ ግብዓት እና ዶቃ የበለጸጉ ናሙናዎች በSDS-PAGE ተተንትነው ወደ PVDF membranes (ሚሊፖሬ፣ #ISEQ00010) በመደበኛ የምዕራባውያን የብሎት ዘዴዎች ተላልፈዋል።ሽፋኖቹ በቲቢኤስ ውስጥ 0.1% tween-20 (TBST) በያዙ 5% ስኪም ወተት (ሳንጎን፣ #A600669) ታግደዋል እና በቅደም ተከተል ከመጀመሪያ እና ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ተተክለዋል።የመጀመሪያ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት በቲቢስቲቲ ውስጥ በ 1:1000 ውስጥ በ 5% የተጣራ ወተት ውስጥ ተጨምረዋል እና በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ.ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት በ 1: 5000 ሬሾ ውስጥ ጥቅም ላይ ውለዋል እና ለ 1 ሰዓት በክፍል ሙቀት ውስጥ ተተክለዋል.ሽፋኖቹ የኬሚዶክ ኤምፒ ኢሜጂንግ ሲስተም በመጠቀም በኬሚሊሚኒሴንስ ታይተዋል።በሥዕሉ ላይ ያሉት ሁሉም ያልተቆራረጡ የብሎቶች እና የጂልስ ቅኝቶች እንደ ጥሬ መረጃ ቀርበዋል.
በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉ ዋና ፀረ እንግዳ አካላት ጥንቸል ፀረ-SFPQ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (CST, ቁጥር 71992), ጥንቸል ፀረ-FUS ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (CST, ቁ. 67840), ጥንቸል ፀረ-NSUN2 ፖሊክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (ፕሮቲን, ቁ. 20854-1- ኤፒ)፣ ጥንቸል ፀረ-mSin3A ፖሊክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (Abcam፣ #ab3479)፣ የመዳፊት ፀረ-መለያ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ (TransGen፣ #HT201-02)፣ የመዳፊት ፀረ-β-አክቲን ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ (TransGen፣ #HC201-01)፣ ጥንቸል ፀረ እንግዳ -CDK2 ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (ABclonal, #A0094), ጥንቸል ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ ለ CTBP1 (ABclonal, #A11600), ጥንቸል ፖሊክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት ለ DUT (ABclonal, #A2901), ጥንቸል ፖሊክሎናል ፀረ እንግዳ ለ PSMC4 (ABclonal, #A2505), ጥንቸል ፀረ- DNAJB1 ፖሊክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (ABclonal, # A5504).እነዚህ ፀረ እንግዳ አካላት በ TBST ውስጥ በ 5% የተጣራ ወተት በ 1:1000 ማቅለጫ ላይ ጥቅም ላይ ውለዋል.በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉት ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ፀረ-ጥንቸል IgG (TransGen, #HS101-01) ፀረ-መዳፊት IgG (TransGen, #HS201-01) በ 1:5000 ማቅለጫ ውስጥ ያካትታሉ.
BRD4 ከSFPQ ጋር መገናኘቱን የበለጠ ለመመርመር፣ የተረጋጋ HEK293T እና BRD4-miniSOG ህዋሶች HEK293T ከመጠን በላይ የሚጨምሩት በ10 ሴ.ሜ ምግቦች ውስጥ ተለጥፈዋል።ህዋሶች በቀዝቃዛ ፒቢኤስ ታጥበው በ 1 ml ፒርስ አይ ፒ ሊሲስ ቋት (ቴርሞ ፊሸር፣ #87787) ከ EDTA-ነጻ ፕሮቲን መከላከያ ጋር ለ30 ደቂቃዎች በ4°ሴ።ከዚያ በኋላ, ሊዛኖቹ በ 1.5 ሚሊ ሜትር ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች ውስጥ ተሰብስበው በ 15,871 xg በ 10 ደቂቃ ውስጥ በ 4 ° ሴ.ከመጠን በላይ ያለው ንጥረ ነገር ተሰብስቦ በ 5 μg ፀረ-V5 ምልክት የተደረገበት የመዳፊት ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (CST, #80076) በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ.በግምት 50µl ፕሮቲን A/G መግነጢሳዊ ዶቃዎች (MCE፣ #HY-K0202) ሁለት ጊዜ PBS 0.5% Tween-20 ባለው ያጠቡ።ከዚያም የሴል ሊዛዎች ከታች ወደ ላይ በማዞር በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ለ 4 ሰአታት በማግኔት ዶቃዎች ተጭነዋል.ከዚያም ዶቃዎቹ በ 1 ሚሊር የ PBST ቋት አራት ጊዜ ታጥበው በ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች ያበስላሉ.ናሙናዎች በኤስዲኤስ-ገጽ ጄል ላይ ተተንትነው ወደ PVDF membranes ተላልፈዋል መደበኛ የምዕራባውያን የብሎት ዘዴዎች።ሽፋኖቹ በ TBST ውስጥ በ 5% የተጣራ ወተት ውስጥ ተዘግተዋል እና በቅደም ተከተል ከመጀመሪያ እና ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ተዳክመዋል.ዋናው አንቲቦዲ ጥንቸል ፀረ-SFPQ ሞኖክሎናል ፀረ እንግዳ አካላት (CST, #71992) በ 1:1000 በ 5% የተጣራ ወተት በ TBST ውስጥ ጥቅም ላይ ውሏል እና በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ.ፀረ-ጥንቸል IgG በ 1: 5000 ጥምርታ ጥቅም ላይ ይውላል እና በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 1 ሰዓት ተክሏል.ሽፋኖቹ የኬሚዶክ ኤምፒ ኢሜጂንግ ሲስተም በመጠቀም በኬሚሊሚኒሴንስ ታይተዋል።
ለሟሟ ተደራሽ የገጽታ አካባቢ (SASA) ትንተና የሚያገለግሉ ሁሉም መዋቅሮች የተገኙት ከፕሮቲን ዳታ ባንክ (PDB)52 ወይም ከአልፋ ፎልድ ፕሮቲን መዋቅር ዳታቤዝ53 ነው።ፍፁም SASA የፍሪሳሳ ፕሮግራምን በመጠቀም ለእያንዳንዱ ቅሪት ይሰላል።ለእያንዳንዱ መዋቅር አማካኝ SASAን ለማግኘት ሙሉ እና የማያሻማ የSASA መረጃ ለተሰየመ histidine እና ጎረቤቶቹ ብቻ ጥቅም ላይ ውለዋል።ለእያንዳንዱ ሂስቲዳይን አንጻራዊ የማሟሟት ተደራሽነት (RSA) የሚሰላው ፍፁም የSASA እሴትን ለሟሟው ባለው ከፍተኛው በተቻለ ቀሪው የገጽታ ቦታ በማካፈል ነው።አማካኝ RSA ከ 20% በታች ከሆነ ሁሉም ሂስታዲንዶች ተደብቀዋል ፣ አለበለዚያ ተጋልጠዋል56።
በዲዲኤ ሁነታ የተገኙ ጥሬ ፋይሎች ፕሮቲን ዲስከቨር (v2.5) ወይም MSfragger (Fragpipe v15.0)ን በመጠቀም የተፈለጉት በተገቢው የስዊስፕሮት የተረጋገጠ የፕሮቲን ዳታቤዝ ውስጥ የጋራ ብክለትን በያዘ።የ peptides ሙሉ ትራይፕሲን በሁለት የጎደሉ የመለያያ ቦታዎች፣ ካርቦሞይል ሜቲላይሽን እንደ ቋሚ ማሻሻያ እና ሜቲዮኒን ኦክሳይድ እንደ ተለዋዋጭ ማሻሻያ ያስፈልጋቸዋል።ቀዳሚ እና ቁርጥራጭ የክብደት መቻቻል ወደ 10 ፒፒኤም እና 0.02 ዳ (ኤምኤስ2 ኦርቢትራፕ) በቅደም ተከተል ተቀምጧል። የተበከሉ ስኬቶች ተወግደዋል፣ እና ፕሮቲኖች የ<1% የውሸት ግኝት መጠን ለማግኘት ተጣርተዋል። የተበከሉ ስኬቶች ተወግደዋል፣ እና ፕሮቲኖች የ<1% የውሸት ግኝት መጠን ለማግኘት ተጣርተዋል። Попадания загрязняющих веществ были UDALENы, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфотуцие. የውሸት የመለየት መጠን <1% ለመስጠት የተበከለ ንክኪዎች ተወግደዋል እና ፕሮቲኖች ተጣርተዋል.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложнарых%. የውሸት አወንታዊ መጠን <1% ለመድረስ የተበከሉ ስኬቶች ተወግደዋል እና ፕሮቲኖች ተጣርተዋል።መለያዎችን ሳይጠቀሙ ለቁጥራዊ ትንተና ፣ መደበኛ የፕሮቲን ይዘት ከሶስት ባዮሎጂያዊ ድግግሞሾች ጥቅም ላይ ውሏል።የፕሮቲን ንዑስ ሴሉላር አካባቢ ትንተና የተካሄደው የጂን ኦንቶሎጂ (GO) ትንተና ከ DAVID Bioinformatics Resources፣ MitoCarta 3.0 እና በአሊስ ቲንግ ቡድን የተጠናከረ እና የታተመ የውሂብ ጎታዎችን በመጠቀም ነው።የእሳተ ገሞራ ካርታው የተገኘው ከፐርሴየስ (v1.6.15.0) ነው። የፕሮቲን የተትረፈረፈ መታጠፍ ለውጦች ለስታቲስቲክስ ጠቀሜታ ባለ ሁለት ጎን ቲ-ፈተሻ ተፈትነዋል፣ እና የፕሮቲን ምቶች በብዛት ለውጥ>2 (ካልተገለጸ በስተቀር) እና p value <0.05. የፕሮቲን የተትረፈረፈ መታጠፍ ለውጦች ለስታቲስቲክስ ጠቀሜታ ባለ ሁለት ጎን ቲ-ፈተሻ ተፈትነዋል፣ እና የፕሮቲን ምቶች በብዛት ለውጥ>2 (ካልተገለጸ በስተቀር) እና p value <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. የፕሮቲን ይዘት መታጠፍ ለውጦች ለስታቲስቲካዊ ጠቀሜታ ባለ ሁለት ጭራ ቲ-ፈተሻ ተፈትነዋል፣ እና የፕሮቲን ግጥሚያዎች በይዘት ለውጥ>2 (ካልተገለጸ በስተቀር) እና አፕ እሴት <0.05 ጋር ተለይተዋል።使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 蛋白质 丰度 丰度 倍数 变化 的 显着性 显着性 统计 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 2 (除非 除非 有 说明) 和 p 值 p 值 <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 蛋白质 倍 变化 的 的 的 统计 统计 蛋白质 蛋白质 命 命 命 的 的 变化 的 的 丰度 丰度 丰度 的 的 丰度 丰度 丰度 丰度 丰度 的 变化 变化 变化 2 和 P 值 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. በፕሮቲን ይዘት ውስጥ የመታጠፍ ለውጦች ስታቲስቲካዊ ጠቀሜታ በሁለት-ጅራት ቲ-ሙከራ የተፈተነ ሲሆን የፕሮቲን ግጥሚያዎች ለይዘት ለውጦች>2 (ካልተገለጸ በስተቀር) እና p-እሴቶች <0.05 ተወስነዋል።የፕሮቲን መስተጋብር ትንተና የተካሄደው ከ String ዳታቤዝ ጋር በመሆን የGO ትንታኔን በመጠቀም ነው።
ሶስት ባዮሎጂካል ብዜቶች በተመሳሳይ ውጤት ተካሂደዋል.ስታቲስቲካዊ ትንታኔ በግራፍፓድ ፕሪዝም (ግራፍፓድ ሶፍትዌር) እና የእሳተ ገሞራ እቅዶች በፐርሴየስ (v1.6.15.0) ተፈጥረዋል።ሁለቱን ቡድኖች ለማነጻጸር p-values ​​የሚወሰኑት ባለሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራን በመጠቀም ነው።በሙከራ ቡድን ውስጥ ቢያንስ ሁለት ጊዜ ተለይተው የሚታወቁት ነጠላ ፕሮቲኖች ብቻ በእሳተ ገሞራ ፕላኔቶች ውስጥ ተካተዋል ፣ እና በቁጥጥር ቡድኑ ውስጥ ያሉት ተዛማጅ የጎደሉ እሴቶች ከመደበኛ ስርጭት በ Perseus ተተክተዋል p-value ሊሰላ።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።ለስታቲስቲክስ ትንተና በፕሮቲዮሚክ ትንታኔዎች ውስጥ ቢያንስ በሁለት ባዮሎጂያዊ ቅጂዎች ውስጥ የታዩ ፕሮቲኖች ብዛት ተጠብቆ ቆይቷል።የናሙና መጠኑን አስቀድሞ ለመወሰን የስታቲስቲክስ ዘዴዎች ጥቅም ላይ አልዋሉም.ሙከራዎቹ በዘፈቀደ አይደሉም።በሙከራው እና በውጤቶቹ ግምገማ ወቅት ተመራማሪዎቹ ለተግባሮቹ ዓይነ ስውር አልነበሩም.
በጥናት ንድፍ ላይ ተጨማሪ መረጃ ለማግኘት ከዚህ ጽሁፍ ጋር የተገናኘውን የተፈጥሮ ምርምር ዘገባን ይመልከቱ።
በዚህ ጥናት ውስጥ የተገኘው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ መረጃ ለProteomeXchange Consortium በ iProX57 አጋር ማከማቻ በውሂብ ስብስብ መታወቂያ PXD034811 (PDPL-MS ዳታሴስት) ቀርቧል።ጥሬ መረጃ የሚቀርበው በጥሬ መረጃ ፋይሎች መልክ ነው።ይህ ጽሑፍ ዋናውን ውሂብ ያቀርባል.
ጂንግራስ፣ ኤሲ፣ አቤ፣ ኬቲ እና ራውት፣ ቢ. አካባቢውን ማወቅ፡ የፕሮቲን ውስብስቦችን እና የካርታ አካላትን ለመለየት በቅርበት ላይ የተመሰረተ ባዮቲኒላሽን በመጠቀም። ጂንግራስ፣ ኤሲ፣ አቤ፣ ኬቲ እና ራውት፣ ቢ. አካባቢውን ማወቅ፡ የፕሮቲን ውስብስቦችን እና የካርታ አካላትን ለመለየት በቅርበት ላይ የተመሰረተ ባዮቲኒላሽን በመጠቀም።ጂንግራስ፣ AS፣ Abe፣ KT እና Raut፣ B. ከአካባቢው ጋር መተዋወቅ፡ የፕሮቲን ውስብስቦችን እና የካርታ አካላትን ለመለየት በቅርበት ላይ የተመሰረተ ባዮቲኒላሽን በመጠቀም። ጂንግራስ፣ ኤሲ፣ አቤ፣ ኬቲ እና ራውት፣ ቢ. ጂንግራስ፣ ኤሲ፣ አቤ፣ ኬቲ እና ራውት፣ ቢ. አካባቢውን መረዳት፡ የሰፈሩን ጥገኝነት በባዮሎጂያዊ ህይወት ተጠቀም።ጂንግራስ፣ AS፣ Abe፣ KT እና Raut፣ B. የቀረቤታ ግንዛቤ፡ የፕሮቲን ውህዶች ባህሪይ እና የአካል ክፍሎችን በቅርበት-ጥገኛ ባዮቲንላይዜሽን በመጠቀም ካርታ መስራት።የአሁኑ።የኔ አመለካከት.ኬሚካል.ባዮሎጂ 48, 44-54 (2019).
Geri, JB እና ሌሎች.የዴክስተር ሃይልን ወደ በሽታ ተከላካይ ሕዋሳት በማስተላለፍ የማይክሮ ህዋሱን ካርታ መስራት።ሳይንስ 367፣ 1091–1097 (2020)።
ሄርትሊንግ፣ ኤል እና ሌሎች።ባለ ሁለት-ፕሮቲን ሚዛን ኔትወርኮች ሴል-ተኮር የሰውን መስተጋብር ማሻሻያ ለይተው ያውቃሉ።ሕዋሶች 184, 3022-3040.e3028 (2021).